Λειτουργική ανάλυση της μετατοπασης tim12 του μιτοχονδριακού συμπλόκου μετατόπισης πρωτεϊνών tim22

 
This item is provided by the institution :
University of Crete
Repository :
E-Locus Institutional Repository
see the original item page
in the repository's web site and access all digital files if the item*
share




2005 (EN)
Λειτουργική ανάλυση της μετατοπασης tim12 του μιτοχονδριακού συμπλόκου μετατόπισης πρωτεϊνών tim22

Λιονάκη, Ειρήνη

Η πρωτεΐνη Tim12 του Saccharomyces cerevisiae, είναι μία μιτοχονδριακή πρωτεΐνη του διαμεμβρανικού χώρου που ανήκει στην οικογένεια των μικρών Tim. Οι μικρές Tim σχηματίζουν διαλυτά σύμπλοκα στο διαμεμβρανικό χώρο που λειτουργούν ως σαπερόνες των υδρόφοβων προ-πρωτεϊνών που στοχεύνται στη εσωτερική μιτοχονδριακή μεμβράνη. Η πρωτεΐνη Tim12 είναι η μόνη μικρή Tim πρωτεΐνη που είναι αποκλειστικά προσδεδεμένη περιφερικά με την επιφάνεια της εσωτερικής μεμβράνης. Αποτελεί μέρος του συμπλόκου ΤΙΜ22 που εισάγει τις πολυτοπικές πρωτεΐνες στην εσωτερική μεμβράνη. Ο ρόλος της στην είσοδο των προ-πρωτεϊνών δεν είναι γνωστός, αν και γνωρίζουμε ότι δρα μετά την πρόσδεση του υποστρώματος με το σύμπλοκο ΤΙΜ10. Στην παρούσα εργασία, μελετήθηκαν τα μεταλλάγματα προλίνης της πρωτεΐνης Tim12. H Tim12 περιλαμβάνει τρεις προλίνες (Ρ46, Ρ53, Ρ88) οι οποίες μεταλλάχθηκαν σε αλανίνες. Βρέθηκε ότι το μετάλλαγμα P88A είναι θνησιγόνο, σε αντίθεση με το Ρ46Α, που αναπτύσσεται όπως το αγρίου τύπου στέλεχος. Εντούτοις, η μεταλλαγή της προλίνης 88 δεν βρέθηκε να επηρεάζει ούτε την είσοδο της Tim12 στα μιτοχόνδρια ούτε την στόχευσή της στην περιφέρεια της εσωτερικής μεμβράνης. In vitro, η ανασυνδυασμένη μορφή της Tim12 και των μεταλλαγμάτων της παρουσιάζουν τον ίδιο βαθμό ολιγομερισμού ενώ η σταθερότερη μορφή τους είναι η διμερισμένη. Παράλληλα, σε μεμβράνη με ακινητοποιημένα πεπτίδια του υποστρώματος AAC, βρέθηκε ότι το διμερές του μεταλλάγματος αλληλεπιδρά με τις διαμεμβρανικές περιοχές του υποστρώματος όπως και το αγρίου τύπου διμερές. Τα μεταλλάγματα προλίνης καθώς και η αγρίου τύπου πρωτεΐνη φαίνεται να αλληλεπιδρούν εξίσου με την πρωτεΐνη Tim9, σε πειράματα συμμετανάστευσης σε διάλυμα βαθμίδωσης συγκέντρωσης σουκρόζης. Εντούτοις, το τρυπτικό πρότυπο της μεταλλαγμένης Τim12, κατά την αλληλεπίδραση με την Tim9, διαφέρει ελαφρώς από το τρυπτικό πρότυπο της αγρίου τύπου Tim12 κατά την αλληλεπίδραση με την Tim9. Προτείνεται ότι η προλίνη 88 μπορεί να παίζει σημαντικό ρόλο στην αλλαγή διαμόρφωσης στο μόριο της Tim12, κατά την αλληλεπίδρασή της με τη Tim9, γεγονός που είναι απαραίτητο για την περαιτέρω απόδοση του υποστρώματος από το σύμπλοκο TIM10 στο σύμπλοκο ΤΙΜ22, μέσω του οποίου θα ενσωματωθεί στην εσωτερική μιτοχονδριακή μεμβράνη. (EL)
Tim12 is a mitochondrial intermembrane space (IMS) protein of Saccharomyces cerevisiae. It belongs to the family of the small Tims (Translocases of the Inner Membrane). The small Tims assemble into soluble complexes that chaperone the hydrophobic polytopic inner membrane proteins through the aqueous IMS. Tim12 is the only small Tim that is exclusively associated to the IMS side of the inner membrane (IM). It is part of the TIM22 complex that inserts the polytopic preproteins into the inner membrane. Its precise function in the import pathway of the pre-proteins is not known, although it’s known that Tim12 functions after the recognition of the substrate by the TIM10 complex. In this study, we analyzed proline to alanine mutants in each of the three proline residues (P46, P53 and P88) of Tim12. We found that P88A mutant is lethal, in contrast to P46A mutant. However, the P88A mutation does not affect the import of Tim12 in mitochondria, or targeting to the IM surface. Recombinant wild type and mutant Tim12 display the same oligomerization behaviour in vitro, whilst, for both of them the dimer is the most stable form. With peptide spot analysis, using a membrane with immobilized peptides of the substrate AAC, we found that both the wild type and the P88A mutant dimers interact with the transmembrane domains of AAC. Migration on sucrose gradients revealed that the proline mutants maintain the capacity to interact with the Tim9 monomer as does the wild type Tim12. However, as shown by limited proteolysis the tryptic profile of TimP88A upon interaction with Tim9 is slightly different from that of Tim12wt upon interaction with T9. We propose that proline 88 is crucial for structural changes of the Tim12 molecule during its interaction with Tim9, which are necessary for the downstream translocation of the substrate onto the TIM22 complex and its final insertion into the inner membrane. (EN)

text
Τύπος Εργασίας--Μεταπτυχιακές εργασίες ειδίκευσης

Πανεπιστήμιο Κρήτης (EL)
University of Crete (EN)

Greek

2005-11-28


Σχολή/Τμήμα--Σχολή Θετικών και Τεχνολογικών Επιστημών--Τμήμα Βιολογίας--Μεταπτυχιακές εργασίες ειδίκευσης



*Institutions are responsible for keeping their URLs functional (digital file, item page in repository site)