Στην παρούσα εργασία έγινε μελέτη του συμπλόκου που σχηματίζουν οι πρωτεΐνες HrcQa & HrcQb. Οι δύο πρωτεΐνες, αποτελούν μέρη του βασικού σώματος του τύπου ΙΙΙ εκκριτικού συστήματος, μιας πολυπρωτεϊνικής εκκριτικής μηχανής που συναντάται στα παθογόνα βακτήρια, και η οποία είναι αφιερωμένη στην εξ επαφής μεταφορά παθογόνων παραγόντων στο κυτταρόπλασμα του κυττάρου ξενιστή. Βάσει των έντονων ομοιοτήτων των HrcQa/ HrcQb με τις FliM/FliN του βακτηριακού μαστιγίου, έχει προταθεί ότι οι δύο πρωτεΐνες σχηματίζουν μία υπερμοριακή δομή ανάλογη αυτής του κυτταροπλασματικού δακτυλίου (C-ring) του μαστιγίου, ο οποίος τοποθετείται στην απόληξη του βασικού σώματος.
Σε προηγούμενες δουλειές είχε δειχθεί ότι οι δύο πρωτεΐνες αλληλεπιδρούν, αλλά δεν είχε καταστεί δυνατή η απομόνωση διαλυτού συμπλόκου. Από πειράματα υποκυτταρικού εντοπισμού που είχαν πραγματοποιηθεί στο παρελθόν αλλά και από βιουπολογιστικές μελέτες, διαπιστώθηκε ότι το πρόβλημα της διαλυτότητας οφείλεται σε υδρόφοβες περιοχές της HrcQa και συγκεκριμένα στην αμινοτελική της περιοχή. Για την επίτευξη της απομόνωσης διαλυτού συμπλόκου, σχεδιάστηκε μία μορφή του συμπλόκου από την οποία αποκλείστηκαν τα 80 πρώτα αμινοτελικά κατάλοιπα της HrcQa. Η γονιδιακή κατασκευή περιελάμβανε την υπολειμματική αυτή μορφή της HrcQa (HrcQa-Nter) καθώς και την πλήρους μήκους HrcQb η οποία έφερε ακροφύσιο 6 ιστιδινών στο καρβοξυτελικό της άκρο.
Το αποτέλεσμα ήταν η απομόνωση διαλυτού συμπλόκου. Το σύμπλοκο απομονώθηκε με χρωματογραφία Ni-NTA, για το οποίο μόνο η HrcQb-His είχε συγγένεια. Ο συνκαθαρισμός των δύο πρωτεϊνών ήταν αποτέλεσμα του σχηματισμού συμπλόκου. Η στοιχειομετρία του συμπλόκου προβλέπεται ~ 1:3-1:4 (HrcQa:HrcQb) βάσει της στοιχειομετρίας που έχει παρατηρηθεί στο ομόλογο σύμπλοκο FliM:FliN από το βακτηριακό μαστίγιο. Δεδομένου ότι iii
οι δύο πρωτεΐνες εκφράζονται ισόποσα, η περίσσεια της HrcQa-Nter ανακτάται σε ένα πρώιμο βήμα έκλουσης από τη στήλη Ni-NTA.
Η μορφή αυτή του συμπλόκου παρουσίασε πρόβλημα πρωτεόλυσης μετά το πέρας μερικών ημερών από την απομόνωσή του. Η πρωτεόλυση συνέβη στην πρωτεΐνη HrcQa-Nter, με ειδικό τρόπο, ώστε να προκύπτει μια ελλειμματική μορφή της ~14 kDa. Η ελλειμματική αυτή μορφή της HrcQa όχι μόνο είναι ιδιαίτερα σταθερή αλλά διατηρεί την ικανότητα για αλληλεπίδραση με τη HrcQb προς σχηματισμό συμπλόκου. Η ταυτοποίηση της περιοχής αυτής πραγματοποιήθηκε με φασματομετρία μάζας η οποία υπέδειξε την περιοχή των αμινοξέων 129-238 στο καρβοξυτελικό άκρο της πρωτεΐνης, επιβεβαιώνοντας προηγούμενα αποτελέσματα τα οποία ανέφεραν την καρβοξυτελική περιοχή της HrcQa ως αναγκαία και επαρκή για την αλληλεπίδραση με τη HrcQb. Βελτιστοποίηση του προτοκόλου απομόνωσης συνέβαλε ώστε το πρόβλημα σχεδόν να εξαλειφθεί.
Το σύμπλοκο σχηματίζει μεγαλομοριακές δομές, των οποίων τα ακριβή μοριακά βάρη δεν κατέστη δυνατόν να προσδιοριστούν.
Για τη HrcQa-Nter προσδιορίστηκε το μοριακό βάρος και η υδροδυναμική ακτίνα δύο πληθυσμών που διαχωρίζονται κατά τη χρωματογραφία μοριακής διήθησης και οι οποίοι αντιστοιχούν (βάσει θεωρητικών υπολογισμών) σε 10μερές και 5μερές με μεγαλύτερη αφθονία να παρουσιάζει ο πληθυσμός που αντιστοιχεί σε 10μερές.
Επιχειρήθηκαν προκαταρκτικές δομικές μελέτες για το σύμπλοκο με τη μέθοδο της σκέδασης ακτίνων Χ από διάλυμα σε μικρές γωνίες. Οι μετρήσεις δεν ήταν επαρκείς, ωστόσο απέδωσαν τρισδιάστατα μοντέλα για το σχήμα των μεγαλομοριακών δομών που σχηματίζει το σύμπλοκο των δύο πρωτεϊνών.
Τέλος, στα πλαίσια της εργασίας σχεδιάστηκαν γονιδιακές κατασκευές οι οποίες αποσκοπούσαν σε σταθερότερα προϊόντα. Τα προϊόντα που αποδίδουν βρίσκονται ακόμη υπό μελέτη.
(EL)
At the present work, the HrcQa-HrcQb complex was studied. The two proteins are part of the type III secretion system basal body. The type III secretion system is a multiprotein pathogenicity machinery through which Gram negative bacteria deliver virulence proteins directly into the cytoplasm of the host cell. Based on the striking analogies between HrcQa/HrcQb and FliM/FliN it has been proposed that HrcQa-HrcQb complex might form a macromolecular structure similar to that of the cytoplasmic ring (C-ring) of the flagellum, which is placed at the bases of the basal body cylinder.
Previous studies have shown that the two proteins interact, but the efforts for the isolation of a soluble complex remained unsuccessful. Subcellular localization experiments performed in the past, as well as biocomputic studies, indicate that the solubility problem is caused due to hydrophobic regions of the HrcQa protein located at its N-terminus. For the isolation of a soluble product, a form of the complex was designed to contain HrcQa lacking its first 80 N-terminal residues (HrcQa-Nter) and the full-length HrcQb carrying a 6 histidine tag.
That form of the complex was indeed soluble. It was isolated via Ni-NTA chromatography, for which only HrcQb-His had affinity. The co-purification of the two proteins was the result of the complex formation. The stoichiometry of the complex is expected to be similar to that of the flagellum counterparts which is ~1:3-1:4 (FliM:FliN→HrcQa:HrcQb). Given that HrcQa and HrcQb are expressed in equal amounts, excess of HrcQa-Nter is recovered in an early elution step.
The HrcQa-Nter-HrcQb-His complex displayed a degradation problem due to proteolysis in the course of few days after isolation. HrcQa-Nter was affected by proteolysis in a specific way, resulting in fragment of about 14 kDa. This truncated form of HrcQa not only is it stable
but it retains the ability of complex formation with ΗrcQb-His. The identification of the truncated HrcQa was done via mass spectrometry which indicated the C-terminus of the protein and specifically residues 129-238, confirming previously reported results which described the C-terminal region of HrcQa to be necessary and sufficient for the binding of HrcQb. Improvement of the isolation protocol resulted in the elimination of the proteolysis problem and more stable products.
HrcQa-HrcQb complex forms macromolecular structures the exact molecular weight of which is not determined in the present work.
For HrcQa-Nter , the molecular weight and hydrodynamic radius was determined for both of the populations that are separated by size exclusion chromatography and correspond to a decamer and a pentamer.
Primary structural studies were attempted for the complex with the method of small angle X ray scattering from solution. Although the original data were not sufficient, an idea for the shape of the complex in solution was derived after analysis and modeling.
Finally, constructs designed to express more stable products are presented here though their study is still in progress.
(EN)
