Στην εργασία αυτή μελετήθηκε η τοπολογία και ο ρόλος των πρωτεϊνών του Φωτοσυστήματος ΙΙ. Η μελέτη αυτή επιτεύχθηκε με χρήση πρωτεολυτικών ενζύμων και αντιδραστηρίων πρωτεϊνικής διασύνδεσης (cross-linkers). Επίσης, με χρήση αλάτων εξετάστηκε η επίδραση της ιονικής ισχύος στην πρωτεϊνική σύσταση και λειτουργία του συμπλόκου και ο ανταγωνισμός αρνητικά φορτισμένων ιόντων για τη θέση του χλωρίου. Διαλυτοποίηση PS II-μεμβρανών με το απορρυπαντικό 6-Ο-(Ν-επτακαρβαμυλο)-μεθυλο-α-D-γλυκοπυρανοσίδιο (HECAMEG) επέτρεψε την απομόνωση ενός πυρήνα του Φωτοσυστήματος ΙΙ, που είχε την ικανότητα να εκλύει οξυγόνο σε υψηλούς ρυθμούς, διατηρώντας τις εξωτερικές πρωτεΐνες 17, 23 και 33 kDa. Μετρήσεις έκλυσης Η+ έδειξαν ότι η στοιχιομετρία έκλυσης Η+ κατά τον κύκλο των S-καταστάσεων είναι σχεδόν 1:1:1:1 στο σύμπλοκο αυτό, το οποίο έχει και τις τρεις εξωτερικές πρωτεΐνες. Το αποτέλεσμα αυτό σημαίνει ότι οι εξωτερικές πρωτεΐνες 17 και 23 kDa δεν επηρεάζουν τη στοιχιομετρία, εφόσον προηγούμενες μελέτες είχαν πραγματοποιηθεί μόνο σε πυρήνες, οι οποίοι δεν περιείχαν τις μικρές εξωτερικές πρωτεΐνες και έδιναν την ίδια στοιχιομετρία. Κατεργασία του πυρήνα αυτού με χαμηλές συγκεντρώσεις του πρωτεολυτικού ενζύμου της θρυψίνης είχε σαν αποτέλεσμα την πρωτεόλυση της πρωτεΐνης D1, ενώ οι εξωτερικές πρωτεΐνες 17, 23 και 33 kDa, όπως και το σύμπλοκο του μαγγανίου παρέμεναν ανεπηρέαστα. Η κατεργασία αυτή είχε σα συνέπεια την ελάττωση της ταχύτητας έκλυσης Ο2, διατηρώντας το 65% της ενεργότητας σε σύγκριση με τον πυρήνα, που δεν είχε υποστεί τη συγκεκριμένη κατεργασία. Η στοιχιομετρία έκλυσης Η+ στο κατεργασμένο δείγμα διατηρήθηκε σε 1:1:1:1 κατά τον κύκλο των S-καταστάσεων, που σημαίνει ότι η επεξεργασία με τη θρυψίνη δεν επηρεάζει τη στοιχιομετρία. Ανάλογα αποτελέσματα από την επεξεργασία με τη θρυψίνη προέκυψαν και σε πυρήνες Φωτοσυστήματος ΙΙ, οι οποίοι είχαν απομονωθεί με άλλα απορρυπαντικά. Προκειμένου να εξηγηθεί η παρατηρούμενη ελάττωση στο ρυθμό παραγωγής Ο2, μετά την κατεργασία με τη θρυψίνη, παρόλο που τόσο η οξειδωτική όσο και η αναγωγική πλευρά δε φαινόταν να επηρεάζονται, εξετάστηκε η ευαισθησία του συμπλόκου ως προς τη θερμοκρασία. Σε θερμοκρασία δωματίου, η ενεργότητα του κατεργασμένου συμπλόκου, σε σύγκριση με το μη κατεργασμένο σύμπλοκο, μειώθηκε σημαντικά, η περιεκτικότητά του σε μαγγάνιο δεν επηρεάζεται, ενώ παρατηρείται εκτεταμένη πρωτεόλυση. Η τοπολογία και η αλληλεπίδραση των εξωτερικών πρωτεϊνών με τις μεμβρανικές πρωτεϊνες του Φωτοσυστήματος ΙΙ, εξετάστηκε με τη χρήση του αντιδραστηρίου πρωτεϊνικής διασύνδεσης (cross-linker) 1-αιθυλο-3-(3-διμεθυλοαμινοπροπυλο)καρβοδιιμίδιο (EDC). Το EDC είναι ένα αντιδραστήριο, που μπορεί να συνδέσει καρβοξυλομάδες με αμινομάδες, οι οποίες βρίσκονται σε van der Waals απόσταση. Με χρήση του αντιδραστηρίου EDC, είχε βρεθεί ότι η 33 kDa πρωτεΐνη αλληλεπιδρά με τη CP 47, αποτέλεσμα που επιβεβαιώθηκε και στην παρούσα εργασία. Ένα άλλο προϊόν cross-linking, το οποίο ανιχνεύθηκε με τη χρήση EDC, προκύπτει από την εξωτερική πρωτεΐνη 23 kDa με την α-υπομονάδα του cyt b559, που σημαίνει ότι οι δύο πρωτεΐνες αλληλεπιδρούν. Προϊόντα cross-linking των εξωτερικών πρωτεϊνών 23 και 17 kDa με την 33 kDa δεν ανιχνεύθηκαν. Αυτό δε σημαίνει απαραίτητα ότι οι εξωτερικές πρωτεΐνες δεν αλληλεπιδρούν μεταξύ τους, αφού μπορεί τα κατάλληλα αμινοξέα να μη βρίσκονται σε θέση τέτοια, ώστε να μπορούν να αντιδράσουν με το EDC και να δώσουν προϊόντα cross-linking. Τέλος, με χρήση του άλατος LiClO4 εξετάστηκε η επίδραση της ιονικής ισχύος στις εξωτερικές πρωτεϊνες και τη λειτουργικότητα του Φωτοσυστήματος ΙΙ, ενώ το άλας KNO2 χρησιμοποήθηκε για να εξεταστεί αν τα NO2- ιόντα ανταγωνίζονται τα ιόντα χλωρίου. Βρέθηκε ότι επεξεργασία PS II-μεμβρανών με 100mM LiClO4 είχε σαν αποτέλεσμα την απομάκρυνση των 23 και 17 kDa, ενώ με συγκέντρωση 500mM LiClO4 παρατηρήθηκε απομάκρυνση και της 33 kDa. Κατεργασία PS II-μεμβρανών με KNO2 έδειξε ότι οι εξωτερικές πρωτεΐνες παρέμεναν ανεπηρέαστες, ενώ παρατηρήθηκε ελάττωση στην ταχύτητα έκλυσης Ο2. Η ελάττωση αυτή μπορεί να εξηγηθεί από πειράματα οπτικής φασματοσκοπίας, τα οποία έδειξαν ότι η επεξεργασία αυτή επηρεάζει την αναγωγική πλευρά του συμπλόκου, προκαλώντας καθυστέρηση στην ηλεκτρονιακή μεταφορά μεταξύ των QA και QB.
(EL)
The interaction of the extrinsic with the intrinsic proteins of the Photosystem II core-complex and their relationship with the inorganic cofactors of PS II is under contention. Solubilization of Photosystem II (PS II) membrαnes with the non ionic detergent 6-O-(N-heptacarbamoyl)-methyl-a-D-glucopyranoside (HECAMEG) allowed the isolation of an oxygen evolving PS II-core complex, which retains the 23 and 17 kDa extrinsic polypeptides. The pattern of proton release as a function of flash number in this PS II complex, which retains all three extrinsic proteins, was found to be close to 1:1:1:1, during the S-state cycle. Previous studies had shown the same pattern, but in core-complexes that had not the 23 and 17 kDa proteins. Thus, the presence of 23 and 17 kDa polypeptides does not change the pattern of proton release. Mild trypsinization of the PS II complex resulted in proteolysis of D1 protein, while all three extrinsic proteins (33,23 and 17 kDa) and the manganese complex remained intact: under these conditions the pattern of proton release remained closed to 1:1:1:1. Although both the donor and acceptor side seem to remain intact after the mild trypsinization, the oxygen evolution activity decreases to 65% compairing to the control core complex. Similar results were obtained with PS II-core complexes, that had been isolated using other detergents. In order to expalain the decrease of oxygen evolution activity, mild trypsinization took place at room temperature. Temperature sensitivity was observed, as the oxygen evolution activity was almost lost, while the manganese content remained intact. The investigation of the interaction of the extrinsic with the intrinsic proteins of the Photosystem II-core complex was also examined, by using chemical substances, which can cross-link some of the proteins. EDC [1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide] is a zero-length cross-linker, which modifies carboxyl groups and cross-links amino groups to carboxyl groups, that are in van der Waals contact. It has been suggested that EDC cross-links the 33 kDa protein with the CP 47. Further examination of the protein cross-linking using EDC, showed that the 23 kDa protein cross-links with the a-subunit of cyt b559, but couldn't give enough information about the interaction of the 33 kDa protein with the 23 and 17 kDa polypeptides. Finally, in order to examine the influence of the ionic strength to the extrinsic proteins and if NO2- competes with the Cl- ions, LiClO4 and KNO2 were used, respectively. It has been found that treatment of PS II membranes with 100mM LiClO4 resulted in 23 and 17 kDa proteins release, while with 500mM LiClO4, 33 kDa protein was also released. Treatment of PS II membranes with KNO2 resulted in slower electron transport from QA to QB, explaining the decrease of oxygen evolution activity that was observed after the treatment, without affecting the extrinsic polypeptides 33,23 and 17 kDa . Finally, in order to examine the influence of the ionic strength to the extrinsic proteins and if NO2- competes with the Cl- ions, LiClO4 and KNO2 were used, respectively. It has been found that treatment of PS II membranes with 100mM LiClO4 resulted in 23 and 17 kDa proteins release, while with 500mM LiClO4, 33 kDa protein was also released. Treatment of PS II membranes with KNO2 resulted in slower electron transport from QA to QB, explaining the decrease of oxygen evolution activity that was observed after the treatment, without affecting the extrinsic polypeptides 33,23 and 17 kDa .
(EN)
