Τα αυτοάνοσα νοσήματα προκαλούνται ως συνέπεια διαταραχών της ανοσολογικής ανοχής του οργανισμού
έναντι αυτοαντιγόνων. Σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση των αυτοδραστικών Τ λεμφοκυττάρων στην
περιφέρεια έχει η οικογένεια των Β7/CD28 μεμβρανικών υποδοχέων. Οι υποδοχείς αυτοί ενεργοποιούνται
μετά από πρόσδεση ειδικών συνδετικών μορίων και διαβιβάζουν σήματα ενεργοποίησης ή καταστολής των Τ
λεμφοκυττάρων. Η ισορροπία μεταξύ «θετικών» και «αρνητικών» σημάτων ενεργοποίησης καθορίζει τελικά
τη δραστικότητα των λεμφοκυττάρων και προστατεύει από την ανάπτυξη αυτοανοσίας. Ο υποδοχέας PD-1
επάγεται στην κυτταρική επιφάνεια ενεργοποιημένων Τ λεμφοκυττάρων και αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό
και την έκκριση φλεγμονωδών κυτταροκινών. Η ενεργοποίηση του PD-1 πραγματοποιείται μέσω ειδικών
συνδετών (PD-1 ligand 1 [PD-L1], PD-L2) που εκφράζονται κυρίως σε αντιγονο-παρουσιαστικά κύτταρα.
Πειράματα σε ζωικά πρότυπα έχουν αναδείξει το σημαντικό ρόλο του PD-1 στη ρύθμιση της
αυτοδραστικότητας και στην ανάπτυξη αυτοανοσίας.
Η ρευματοειδής αρθρίτιδα (ΡΑ) αποτελεί την πρότυπη φλεγμονώδη αυτοάνοση αρθρίτιδα στον άνθρωπο και
χαρακτηρίζεται από χρόνια συστηματική φλεγμονή και καταστροφή διαφόρων ιστών. Τα παθογενετικά
χαρακτηριστικά της ΡΑ είναι η παρουσία αυτοδραστικών Τ λεμφοκυττάρων στην περιφέρεια και τους
προσβεβλημένους ιστούς, η υπερπαραγωγή αυτοαντισωμάτων από τα Β λεμφοκύτταρα και οι αυξημένες
συγκεντρώσεις φλεγμονωδών κυτταροκινών.
Ο κύριος στόχος της παρούσας μελέτης ήταν να διερευνηθεί ο ρόλος του PD-1 και των συνδετών του στη
ρύθμιση των Τ λεμφοκυττάρων που συμμετέχουν στην παθογένεια της αρθρικής βλάβης της ρευματοειδούς
αρθρίτιδας.
Α. Μελέτες σε ανθρώπους:
Εξετάστηκαν 86 ασθενείς με ΡΑ και 227 υγιείς εθελοντές για την παρουσία του PD1.3 μονονουκλεοτιδικού
πολυμορφισμού με τεχνική PCR και χρήση ειδικής νουκλεάσης περιορισμού (PCR-based restriction fragment
length polymorphism analysis). 9ε διαπιστώθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά στη συχνότητα του
πολυμορφισμού μεταξύ ασθενών και υγιών μαρτύρων (15,1% vs 19,4%, p>0,05).
Για να διερευνήσουμε τη συμμετοχή του PD-1 στη ρύθμιση των Τ λεμφοκυττάρων στο σημείο της
φλεγμονής, μελετήσαμε με ανοσοϊστοχημεία την έκφραση του PD-1/PD-L1 σε βιοψίες αρθρικού υμένα από
υγιείς, ασθενείς με οστεοαρθρίτιδα (ΟΑ) και ΡΑ. 9ιαπιστώθηκε αυξημένη έκφραση του PD-1, κυρίως από Τ
CD3+ κύτταρα, σε 8 από τα 9 (89%) δείγματα αρθρικού υμένα ΡΑ, σε σχέση με 2 από τα 8 (25%) και
κανένα από τα 9 (0%) δείγματα ΟΑ και υγιούς αρθρικού υμένα αντίστοιχα. Έκφραση του PD-L1, κυρίως από
μακροφάγα, ανιχνεύθηκε στις βιοψίες από ΡΑ και ΟΑ ενώ στα δείγματα υγιούς ιστού η έκφρασή του ήταν
9
μηδαμινή. Επιπλέον, ο βαθμός της έκφρασης των PD-1/PD-L1 ήταν ανάλογος του βαθμού της φλεγμονής.
Τα ανωτέρω υποδεικνύουν πιθανή συμμετοχή του PD-1/PD-L1 στη ρύθμιση των φλεγμονωδών Τ
κυτταρικών αποκρίσεων σε ιστικό επίπεδο. Στη συνέχεια, μονοπύρηνα κύτταρα αρθρικού υγρού (SFMCs)
απομονώθηκαν από ασθενείς με ΡΑ και ΟΑ και μελετήθηκε η έκφραση των PD-1 και PD-L1 στα CD4+
κύτταρα με κυτταρομετρία ροής. Σε αντιστοιχία με τα αποτελέσματα της ανοσοϊστοχημείας, βρέθηκε
αυξημένη έκφραση του PD-1 στα Τ κύτταρα ΡΑ (24 ± 5% vs. 4 ± 1%, p=0.003), ιδιαίτερα στους
ενεργοποιημένους υποπληθυσμούς (CD69+, CD25+).
Παρά την έκφραση του PD-1 στο περιφερικό αίμα και τους προσβεβλημένους ιστούς (αρθρικός υμένας) των
ασθενών με ΡΑ, η λειτουργία του ανοσορρυθμιστικού συστήματος PD-1/PD-L1 ενδεχομένως να
τροποποιείται στο φλεγμονώδες περιβάλλον της άρθρωσης. Το ενδεχόμενο αυτό εξετάστηκε κατ’αρχήν, με
καλλιέργειες από SFMCs κύτταρα από ΡΑ και ΟΑ, όπου μελετήθηκε η ικανότητα των κυττάρων αυτών να
επάγουν την έκφραση του PD-1 μετά από ενεργοποίησή τους με PMA και ionomycin. Βρέθηκε ότι στην ΡΑ η
ικανότητα αυτή ήταν μειωμένη (επαγωγή του PD-1 από 18 ± 5% σε 29 ± 4% στην ΡΑ και από 5 ± 2% σε
25 ± 4% στην ΟΑ). Στη συνέχεια, CFSE-σημασμένα CD4+ T λεμφοκύτταρα περιφερικού αίματος,
καλλιεργήθηκαν απουσία ή παρουσία 15% εκχυλίσματος αρθρικού υγρού από ΡΑ. Μετά από ενεργοποίηση
με την πρωτεΐνη PD-L1.Fc, διαπιστώθηκε ότι, παρουσία ορού από ΡΑ, η ικανότητα του PD-1 να αναστέλλει
τον Τ κυτταρικό πολλαπλασιασμό ήταν μειωμένη (αδιαίρετα T κύτταρα την ημέρα 5: 65.1 ± 4.7% vs. 81.2
± 7.8%, p=0.028).
Επιπρόσθετα, για να μελετηθεί η ικανότητα του PD-1 να ρυθμίζει την ενεργοποίηση των Τ κυττάρων που
βρίσκονται στο αρθρικό υγρό της ΡΑ, πραγματοποιήθηκαν κυτταροκαλλιέργειες CD4+ T κυττάρων
περιφερικού αίματος και αρθρικού υγρού από ασθενείς με ΡΑ (paired samples), όπου χορηγήθηκαν διάφορες
συγκεντρώσεις PD-L1.Fc ώστε να ενεργοποιηθεί ο υποδοχέας PD-1. Η ικανότητα του PD-1 να περιορίσει τον
πολ/σμό και την παραγωγή IFN-γ από CD4+ Τ κύτταρα της ρευματοειδούς άρθρωσεηςήταν μειωμένη σε
σχέση με τα κύτταρα του περιφερικού αίματος, ιδιαίτερα σε χαμηλές συγκεντρώσεις PD-L1.Fc (αναστολή
πολ/μού 31 ± 9% vs 53 ± 8% p=0.003).
Β. Μελέτες σε ζώα:
Ποντίκια που δεν εκφράζουν PD-1 (PD-1-/-) δημιουργήθηκαν με διαγραφή του διαμεμβρανικού και
ενδοκυττάριου τμήματος του γονιδίου του PD-1. Η αρθρίτιδα επαγόμενη από κολλαγόνο (collagen-induced
arthritis, CIA) σε ποντικούς αποτελεί ένα κλασσικό και καλά μελετημένο πειραματικό πρότυπο αυτοανοσίας
προσομοιάζον στην ανθρώπινη ρευματοειδή αρθρίτιδα.
Η έλλειψη του PD-1 θα μπορούσε να προκαλέσει υπέρμετρη ενεργοποίηση των Τ κυττάρων και επομένως
αύξηση της έντασης και του ποσοστού της αρθρίτιδας. Για να εξετάσουμε αυτή την υπόθεση, προκλήθηκε
10
CIA σε ποντίκια Β6-PD-1-/- με χορήγηση κολλαγόνου τύπου ΙΙ (CII). Παρατηρήθηκε σημαντικά αυξημένο
ποσοστό και ένταση αρθρίτιδας, που εκτιμήθηκε μακροσκοπικά και ιστολογικά, σε σχέση με τα wild type B6
ποντίκια (mean ± SEM of maximum arthritis score, Β6-PD-1-/- : 5.0 ±1.2, n=16, vs Β6 wt: 2.3 ±1.2, n=14,
p=0.040).
Η ενεργοποίηση του συστήματος PD-1/PD-L1, θα μπορούσε να προκαλέσει την αναστολή της διέγερσης των
Τ λεμφοκυττάρων και επομένως να περιορίσει τον βαθμό της επαγόμενης αρθρίτιδας. Σε Β6 ποντίκια, στο
πειραματικό πρότυπο της CIA, χορηγήθηκε η συνθετική πρωτεΐνη PD-L1.Fc (που αποτελείται από το
εξωκυττάριο τμήμα του PD-L1 και το Fc τμήμα της IgG2a ανοσοσφαιρίνης) που ενεργοποιεί το PD-1 in vivo,
στο στάδιο πρόκλησης της αρθρίτιδας (πρώτες 10 ημέρες). Στα ποντίκια αυτά παρατηρήθηκε ηπιότερη
αρθρίτιδα (μέση ένταση αρθρίτιδας: 1.8 ± 0.6) σε σχέση με τους μάρτυρες, που δεν έλαβαν τη θεραπεία
(2.5 ± 0.7) (n=5 σε κάθε ομάδα).
Συμπερασματικά, τα ευρήματα της μελέτης αυτής υποστηρίζουν ένα σημαντικό ρόλο του ανασταλτικού
συστήματος PD-1/PD-L1 στη ρύθμιση των Τ λεμφοκυττάρων στη ΡΑ. Τεκμηριώνεται διαταραχή της
έκφρασης και λειτουργίας του PD-1 ως συνέπεια του φλεγμονώδους περιβάλλοντος της ΡΑ. Η έκφραση του
PD-1/PD-L1 στον αρθρικό υμένα της ΡΑ και η έντονη επίδρασή του στην ανάπτυξη αρθρίτιδας σε
πειραματικά ζωικά πρότυπα, υποδεικνύουν συμμετοχή του ανοσορρυθμιστικού αυτού συστήματος στην Τ
ανοσολογική ανοχή, με δυνατότητα παρέμβασης για θεραπευτικούς σκοπούς.
(EL)
The immune system has evolved to protect the body from foreign invading pathogens. To accomplish this
critical role, T lymphocytes must discriminate between self and non-self. Among the mechanisms involved in
safeguarding of self-tolerance, B7/CD28 membrane receptors are crucial for fine-tuning of T cell function.
Programmed death-1 (PD-1) is an inhibitory lymphocyte receptor that has recently emerged as a key player
in induction and maintenance of tolerance.
Rheumatoid arthritis (RA) is a chronic inflammatory disease of joints and extra-articular tissues, which
causes severe disability and premature mortality [1, 2]. Numerous data support a central role of T cells in
RA with these cells thought to be triggered locally in an antigen-specific manner resulting in breakdown of
tolerance, synovial inflammation, and autoantibody production [3-7]. In the collagen-induced arthritis (CIA
animal model of RA, type II collagen (CII)– reactive CD4+ T cells are primary mediators of disease
induction driving autoantibody production by B cells and localized chronic inflammatory response [8-12].
Although the role of co-stimulation is well documented in RA and has been further supported by the efficacy
of CTLA4-Ig in severe RA, the role of this family of molecules has not been explored in a systematic,
organized fashion. We sought to determine the role of PD-1/PD-1 ligands (PD-1L) in RA and test the
hypothesis whether defective expression and/or function of this pathway may contribute to T cell
hyperactivity within the inflamed joint.
Genomic DNA was extracted from peripheral whole blood obtained from patients and healthy blood donors.
Genotyping for the PD1.3A was performed by polymerase chain reaction (PCR). PD-1/PD-1L expression was
examined on synovial tissue and synovial fluid (SF) mononuclear cells from RA patients by
immunohistochemistry and flow cytometry. PD-1 function was assessed in T cells stimulated with anti-CD3
and PD-L1.Fc to crosslink PD-1. Collagen-induced arthritis (CIA) was induced in PD-1-/- C57Bl/6 mice and
recombinant PD-L1.Fc was injected to activate PD-1 in vivo.
A. Human studies
To determine whether PD-1 SNPs are associated with susceptibility to RA in our cohort, we analyzed the
genomic DNA of 86 RA patients and 227 age- and sex- matched healthy controls for the PD1.3 SNP. No
substantial difference in frequencies of PD1.3 heterozygosity (G/A) between RA patients and healthy
controls (15,1% versus 19,4%, p>0,05) was found.
We have shown that RA synovium and SF were enriched in PD-1+ T cells (24 ± 5% vs. 2 ± 1% in
osteoarthritis, p<0.01) and PD-1L+ monocytes/macrophages. And that PD-1 crosslinking inhibited T cell
7
proliferation and IFN-γ production in RA patients. Howewver, despite high expression within the joint, PB T
cells incubated with RA SF and SF T cells from active RA exhibited reduced PD-1–mediated inhibition at
suboptimal –but not optimal– PD-L1.Fc concentrations, indicating a probable diminishing effect of the
inflammatory microenvironment of RA on pathway’s function.
B. Animal studies
PD-1-/- mice demonstrated increased incidence (73% vs. 36% in wild-type mice, p<0.05) and severity
(mean maximum arthritis score 4.8 vs. 2.5, p=0.001) of CIA, associated with enhanced T cell proliferation
and cytokine (IFN-γ, IL-17) production in response to type II collagen. Most interestingly, PD-L1.Fc
treatment ameliorated CIA (mean maximum arthritis score 1.8 ± 0.6 vs. 2.5 ± 0.7) and reduced anticollagen
II T cell responses (induction in proliferation [9cpm] 9594 ± 2147 vs. 4712 ± 2256).
Taken together, our data suggest that τhe negative costimulatory PD-1/PD-1L pathway regulates peripheral
T cell responses in both human and murine RA. The PD-1/PD-1L in rheumatoid synovium may represent an
additional target for immunomodulatory therapy in RA.
(EN)
