Δημιουργία γενετικά τροποποιημένων φυτών πατάτας που φέρουν ανθεκτικότητα στον ιό της πατάτας Y (Potato virus, PVY)

Μίσσιου, Αναστασία

Missiou, Anastasia

Ρουμπελάκη-Αγγελάκη, Καλλιόπη

Τσαγρή, Ευθυμία

Η δημιουργία γενετικά τροποποιημένων φυτών με ανθεκτικότητα σε διάφοτους ιούς είναι ένα συχνό φαινόμενο. Σε αρκετές περιπτώσεις η ανθεκτικότητα ήταν αποτέλεσμα της εισαγωγής ιικών γονιδίων στο φυτικό γένωμα. Βασικός μηχανισμός της ανθεκτικότητας αποτελεί μία μορφή μετά-μεταγραφικής γονιδιακής σίγησης. Η μετά- μεταγραφική γονιδική σίγηση (PTGS) χαρακτηρίζεται από την αναγνώριση του RNA ‘στόχου’ στο κυτόπλασμα, το οποίο στη συνέχεια αποδομείται. ?ίκλωνα μόρια RNA κατέχουν εξέχων ρόλο στο μηχανισμό. Αυτά τα μόρια οδηγούν σε αποδόμηση τα αντίστοιχα ομόλογα μόρια mRNA μέσα στο κύτταρο. Κατά συνέπεια, η εισαγωγή και έκφραση στο φυτικό γένωμα κατασκευών (construct) που παράγουν δίκλωνα μόρια RNA οδηγεί στη σίγηση αντίστοιχων συμπληρωματικών μορίων RNA, τα οποία μπορεί να είναι μετάγραφα διαγονιδίων, ενδογονιδίων ή ακόμα και γένωμα RNA ιού. Ο ιός της πατάτας Υ είναι ένας από τους πιο καταστροφικούς ιούς για την καλλιέργεια πατάτας. Βασισμένοι στο μηχανισμό της σίγησης, σε αυτή την εργασία έγινε προσπάθεια να δημιουργήσουμε γενετικά τροποποιημένες σειρές πατάτας (‘Spunta’ cv.) με ανθεκτικότητα στον ιο Υ. Τα φυτά αυτά είχαν μετασχηματιστεί με DNA κατασκευή (PH-PVY 9100) που περιείχε το γονίδιο της καψιδιακής πρωτεϊνης (CP) του ιού σε θετικό (sense) και αρνητικό (antisense) προσανατολισμό. Κατά τη μεταγραφή η κατασκευή σχηματίζει δίκλωνης μορφής RNA (φουρκέτα). Η μορφή RNA φουρκέτα γίνεται στόχος συγκεκριμένων RNασών του κυττάρου και αποτελεί το έναυσμα για την ενεργοποίηση του μηχανισμού της PTGS με τελικό αποτέλεσμα την παραγωγή siRNA, τα οποία με τη σειρά τους καταστέλλουν την ικανότητα μόλυνσης του ιού. Συγκεκριμένα, δημιουργήθηκαν 32 γενετικά τροποποιημένες σειρές πατάτας, ύστερα από μετασχηματισμό φυτών αγρίου τύπου με την παραπάνω κατασκευή. 19 διαφορετικές σειρές ελέγχθηκαν για την παρουσία του διαγονιδίου με ανάλυση κατά Southern. Σε 14 από τις εξεταζόμενες διαγονιδιακές σειρές το διαγονίδιο ήταν ανιχνεύσιμο. Επίσης στις 18 από τις 26 διαφορετικές σειρές ήταν δυνατή η ανίχνευση siRNA. Στις περισσότερες σειρές που ήταν δυνατή η ανίχνευση siRNA η ανθεκτικότητα ήταν δυνατή. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το ποσοστό ανθεκτικότητας στα των εξεταζόμενων φυτών ανέρχεται στο 75%. Συνοψίζοντας, θα λέγαμε ότι τα παραπάνω αποτελέσματα είναι αρκετά ενθαρρυντικά και αυτό που πλέον απομένει έιναι να ελεγχθεί αν αυτή η μορφή ανθεκτικότητας είναι σταθερή και αποτελεσματική σε μη ελεγχόμενες συνθήκες στο (EL)

The generation of transgenic plants that are resistant to several viruses has been reported frequently. In a number of cases the resistance was a result of the introduction of virus-derived genes. The mechanism underlying this form of resistance appears to be a form of post-transcriptional gene silencing (PTGS). PTGS is characterized by the recognition of transgene target in the cytoplasm followed by its highly specific degradation. Double-stranded RNA (dsRNA) molecules possess a key role in this mechanism. These molecules target and lead to degradation of the corresponding homologous mRNA in the cell. The construction and introduction of such double stranded RNA molecules in the plant genome results in the specific silencing of transgene, endogens and viruses. Potato virus Y (PVY) is one of the most destructive viruses in potato production causing severe losses in potato yield. Based on the mechanism of silencing, in this work we try to generate potato transgenic lines that are resistance to PVY. These plants were transformed with a DNA construct named PH-PVY 9100, containing an inverted repeat of a fragment of a CP-gene of the viral genome, which led to the transcription of RNA able to form of a double stranded RNA. This form of RNA is target of specific Rnases and further induces the mechanism of PTGS. PTGS led to the production of siRNA, which in a most of cases are able to suppress the viral infection. Thirty-two transgenic lines were generated with the above construct. We tested 19 different transgenic lines for the presence of the transgene with Southern blot analysis and we found that in 14 of these lines the transgene was present. Furthermore in 18 out of 26 checked transgenic lines the siRNA were detected. In general, there was a correlation between resistance and the presence of siRNA in transgenic lines. The resistance in tested transgenic plants was estimated in 75%. These results are promising and remain to test if this form of resistance is stable and efficient in field condition. (EN)

text

Τύπος Εργασίας--Μεταπτυχιακές εργασίες ειδίκευσης

Πανεπιστήμιο Κρήτης

E-Locus Ιδρυματικό Καταθετήριο

Elocus

Ελληνική γλώσσα

2002-11-22

2002-10-11

uch.biology.msc//2002missiou

http://elocus.lib.uoc.gr:443/dlib/4/a/d/metadata-dlib-2002missiou.tkl

Σχολή/Τμήμα--Σχολή Θετικών και Τεχνολογικών Επιστημών--Τμήμα Βιολογίας--Μεταπτυχιακές εργασίες ειδίκευσης