Functional expression and characterization of detoxification enzymes in insects and mites

 
This item is provided by the institution :
University of Crete
Repository :
E-Locus Institutional Repository
see the original item page
in the repository's web site and access all digital files if the item*
share




2015 (EN)
Λειτουργική έκφραση και χαρακτηρισμός ενζύμων αποτοξικοποίησης σε έντομα και ακάρεα
Functional expression and characterization of detoxification enzymes in insects and mites

Τσέλιου, Βασίλης

Μπουριώτης, Βασίλης
Βόντας, Ιωάννης

Η μελέτη των ενζύμων μέσω των οποίων γεωργικά παράσιτα αναπτύσσουν ανθεκτικότητα σε εντομοκτόνα έχει ως στόχο την ανάπτυξη νέων μέσων καταπολέμησης και διαχείρισης του προβλήματος και είναι εξαιρετικής σημασίας για την προστασία των καλλιεργειών. Στη διάρκεια της μεταπτυχιακής μου διατριβής μελέτησα γονίδια και ένζυμα αποτοξικοποίησης σε δύο πολύ σημαντικούς εχθρούς καλλιεργειών: Το άκαρι Tetranychus urticae είναι ένα από τα πιο καταστροφικά παράσιτα των καλλιεργειών. Είναι εξαιρετικά πολυφάγο αφού μπορεί να τραφεί με εκατοντάδες φυτών μεταξύ αυτών και φυτά τεράστιας γεωργικής σημασίας. Ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης ενός στελέχους τετρανύχου (Μαραθώνας), ανθεκτικό σε πολλά εντομοκτόνα/ακαρεοκτόνα, έδειξε, μεταξύ άλλων, και δύο GSTs (TuGSTm07, TuGSTm09 ) να σχετίζονται με τον ανθεκτικό αυτό φαινότυπο. Στην παρούσα μελέτη, εκφράστηκαν λειτουργικά τα δύο αυτά ένζυμα και χαρακτηρίστηκαν κινητικά. Ακόμη, ελέγχθηκε η ικανότητα τους να αλληλεπιδρούν με εντομοκτόνα/ακαραιοκτόνα. Το ένζυμο TuGSTm07 έδειξε να αλληλεπιδρά με το bifenthrin, το οποίο και είχε ως αποτέλεσμα την αναστολή της ενεργότητας του ενζύμου σε πρότυπο υπόστρωμα (CDNB) κατά 70%. Η τρισδιάστατη δομή του ενζύμου ΤuGSTm07 προβλέφθηκε βασιζόμενη σε κρυσταλλογραφικά δεδομένα άλλων GST ενζύμων Mu κλάσης από θηλαστικά. Πειράματα docking του ενζύμου με το bifenthrin έδειξαν ότι πιθανότατα το bifenthrin προσδένεται στο ενεργό κέντρο του ενζύμου. Το έντομο Bactocera Oleae (Gmelin) (Diptera: Tephritidae) είναι το πιο σημαντικό παράσιτο της ελιάς και προκαλεί ζημιές που αγγίζουν το 30% στις μεσογειακές χώρες συμπεριλαμβανομένης και της Ελλάδας. Το πυρεθροειδές α-cypermethrin έχει χρησιμοποιηθεί πρόσφατα ενάντια στον δάκο αλλά έχουν παρατηρηθεί αυξημένα επίπεδα ανθεκτικότητας. Πρόσφατα, μετά από εξέταση των αλλαγών στην έκφραση γονιδίων σε ανθεκτικά στελέχη δάκου σε σχέση με ευαίσθητα, δεκατέσσερα γονίδια βρέθηκαν να υπερεκφράζονται από κοινού στα ανθεκτικά στελέχη. Μεταξύ αυτών το contig00436 πιθανό μέλος της οικογένειας CYP6 των κυτοχρωμικών οξειδασών P450s, ταυτοποιήθηκε ως το πιο πιθανό υποψήφιο να σχετίζεται με τον φαινότυπο. Σε αυτήν την μελέτη, ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου επιβεβαίωσε την υπερέκφραση του contig00436 στους ανθεκτικούς πληθυσμούς, κλωνοποιήθηκε σε φορέα έκφρασης PCW-ompA και εκφράστηκε λειτουργικά, ώστε να διερευνηθεί η ικανότητα του να μεταβολίζει το α-cypermethrin in vitro. (EL)
Studying the enzymes by which agricultural pests develop resistance to insecticides, aiming to develop new means of managing and overcoming this resistance, a crucial task for crop protection. I studied detoxification genes and enzymes, which are associated within the resistance phenotype in two major pests: The two spotted spider mite Tetranychus urticae is one of the most damaging pests in agriculture. T. urticae is extremely polyphagous; it can feed on hundreds of plants including important agricultural crops. Genome wide gene expression analysis (micaroarray) of a multiresistant strain of T.urticae (Marathonas) showed, among others, the association of two Mu class Glutathione S tranferases (GSTs), TuGSTm07 and TuGSTm09, with the resistant phenotype. In this study, both were functionally expressed and kinetically characterized and their potential to interact with insecticides/acaricides were examined. TuGSTm07 found to interact with bifenthrin causing 70% inhibition of its CDNB coguncating activity. The IC50 value was determined at 7,7103 ± 0,956 μM, showing strong interaction. The three dimensional structure of TuGSTm07 was predicted based on X-ray of other Mammals’ Mu GST. Docking with bifenthrin was performed and revealed that bifenthrin most likely binds to the active site of the enzyme. Bactocera oleae (Gmelin) (Diptera: Tephritidae) is the most important insect pest of the olive tree, causing 30 % loss of the olive crop in Mediterranean countries including Greece. The pyrethroid α-cypermethrin is currently used against B. oleae, however high levels of resistance have been recently observed. Recently, after examination of the expression changes in resistant populations compared to susceptible, fourteen genes were found to be commonly up-regulated. Among them, contig00436, putative member of the CYP6 cytochrome P450 family, was identified as the most striking hit. In this study, the overexpression of contig00436 was validated in resistant populations by real time quantitative PCR, cloned into pcW-ompA expression vector and functionally expressed, aiming to investigate if it is capable of metabolizing α-cypermethrin in vitro. (EN)

text
Τύπος Εργασίας--Μεταπτυχιακές εργασίες ειδίκευσης

Πανεπιστήμιο Κρήτης (EL)
University of Crete (EN)

English

2015-11-20


Σχολή/Τμήμα--Σχολή Θετικών και Τεχνολογικών Επιστημών--Τμήμα Βιολογίας--Μεταπτυχιακές εργασίες ειδίκευσης



*Institutions are responsible for keeping their URLs functional (digital file, item page in repository site)