The anti-cancer drug Zeocin disturbs the copper-iron homeostasis in Saccharomyces cerevisiae

 
This item is provided by the institution :
University of Crete
Repository :
E-Locus Institutional Repository
see the original item page
in the repository's web site and access all digital files if the item*
share




2015 (EN)
Το αντικαρκινικό φάρμακο Zeocin διαταράσσει την ομοιόσταση χαλκού-σιδήρου στον Saccharomyces cerevisiae
The anti-cancer drug Zeocin disturbs the copper-iron homeostasis in Saccharomyces cerevisiae

Διαλυνάκη, Δήμητρα Χ.

Γαρίνης, Γεώργιος
Αλεξανδράκη, Δέσποινα
Τζαμαρίας, Δημήτρης

Η παρουσία του χαλκού μέσα στους ζωντανούς οργανισμούς είναι εξαιρετικά σημαντική καθώς αποτελεί συμπαράγοντα πρωτεϊνών και ενζύμων απαραίτητα για την διεκπεραίωση βιολογικών λειτουργιών. Στον σακχαρομύκητα S. cerevisiae, μεγάλο μέρος των γονιδίων των πρωτεϊνών που ευθύνονται για την αναγωγή, εισαγωγή, διανομή και αποθήκευση του χαλκού μέσα στο κύτταρο μεταγράφονται από την πρωτεΐνη Mac1 (Metal binding Activator). Σε καλλιέργειες ζύμης που αναπτύχθηκαν σε συνθήκες επαγόμενης βλάβης στο DNA υπό την επίδραση του ραδιομιμητικού Zeocin, έχει παρατηρηθεί ότι το γονίδιο CTR1, το οποίο κωδικοποιεί την πρωτεΐνη υψηλής συγγένειας για την εισαγωγή του χαλκού μέσα στο κύτταρο, παρουσιάζει σημαντικά μειωμένα επίπεδα μεταγραφής ενώ παράλληλα αυξάνεται η μεταγραφή των σιδηρο-ρυθμιζόμενων γονιδίων. Όπως επιβεβαιώθηκε στην παρούσα εργασία, η Zeocin-εξαρτώμενη μείωση της μεταγραφής του γονιδίου CTR1 οφείλεται στην μειωμένη λειτουργικότητα του μεταγραφικού του παράγοντα Mac1, η έκφραση του οποίου δεν επηρεάζεται από το φάρμακο. Η κατανόηση του μηχανισμού δράσης της Zeocin στην μεταγραφή συγκεκριμένων γονιδίων όπως παρατηρήσαμε έχει σημασία, λόγω της ευρείας χρήσης του φαρμάκου ως αντικαρκινικού, ως αντιβιοτικού σε κυτταροκαλλιέργειες και ως ραδιομιμητικού για τη μελέτη της κυτταρικής απόκρισης σε βλάβες DNA. Για να διευκρινιστεί ο λόγος που η πρωτεΐνη Mac1 δεν είναι λειτουργική παρουσία της Zeocin, χρησιμοποιήθηκαν διαφορετικές προσεγγίσεις. Αρχικά, εξετάζοντας την κατανομή της RNA πολυμεράσης ΙΙ στο γονίδιο CTR1, βρέθηκε ότι η στρατολόγηση της RNAPII στον υποκινητή και στην κωδική περιοχή του γονιδίου CTR1, μειώνεται υπό την παρουσία της Zeocin. Η μειωμένη στρατολόγηση της RNAPII είναι αποτέλεσμα της μειωμένης στρατολόγησης του μεταγραφικού παράγοντα Mac1 στον υποκινητή του γονιδίου στις συγκεκριμένες συνθήκες, όπως επιβεβαιώθηκε με πειράματα ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης. Διερευνώντας εάν η Zeocin επιδρά άμεσα στον μεταγραφικό παράγοντα Mac1 βρέθηκε ότι, η ικανότητα του υβριδίου LexA-Mac1 να ενεργοποιεί τη μεταγραφή γονιδίου μάρτυρα δεν μεταβάλλεται παρουσία της Zeocin. Επομένως, το αντιβιοτικό δεν παρεμποδίζει την δράση του καρβοξυ-τελικού άκρου του μεταγραφικού παράγοντα το οποίο είναι υπεύθυνο για μεταγραφική ενεργοποίηση. Ακόμα, το αντιβιοτικό αυτό δεν επάγει την ενδομοριακή αντίδραση του μεταγραφικού παράγοντα μεταξύ του αμινο-τελικού και καρβοξυ-τελικού άκρου της πρωτεΐνης Mac1 καθιστώντας την μεταγραφικά μη ενεργή. Βρέθηκε όμως, με την χρήση στελέχους που εκφράζει τον μεταλλαγμένο και συστατικά ενεργό Mac1up, ότι η Zeocin επιδρά στο άμινο-τελικό του άκρο της πρωτεΐνης, όπου υπάρχει η περιοχή Cu-fist, παρεμποδίζοντας την πρόσδεση του μεταγραφικού παράγοντα στον υποκινητή των γονιδίων στόχων του. Προτείνεται λοιπόν το μοντέλο σύμφωνα με το οποίο, η περιοχή Cu-fist του Mac1, η οποία (όπως μαρτυρά και το όνομα της) προσδένει ιόν χαλκού προκειμένου να προσδεθεί στο DNA, αλληλεπιδρά μέσω του ιόντος με το φάρμακο Zeocin στην χαλκο-χηλική περιοχή του γλυκοπεπτιδίου. Μέσω αυτής της άμεσης αλληλεπίδρασης Zeocin-Mac1 μειώνεται η ικανότητα πρόσδεσης του μεταγραφικού παράγοντα στο DNA και κατ’ επέκταση η μεταγραφή των Mac1-εξαρτώμενων γονιδίων. Παράλληλα μελετήθηκε η πιθανή εμπλοκή πρωτεϊνών που συνεργάζονται με τον Mac1 και σχετίζονται με συνθήκες στρες. Η πρωτεΐνη προσαρμογέας Rad9, εμπλέκεται στην μεταβίβαση σήματος για επιδιόρθωση του DNA όταν έχει υποστεί κάποια βλάβη και έχει βρεθεί ότι αλληλεπιδρά με το μεταγραφικό παράγοντα Mac1 μειώνοντας την δράση του σε φυσιολογικές συνθήκες ανάπτυξης του σακχαρομύκητα (Gkouskou 2007). Βρήκαμε ότι η απουσία της Rad9 δεν επηρεάζει περαιτέρω παρουσία Zeocin τη λειτουργικότητα του Mac1 στα μεταγραφικά εξαρτώμενα γονίδια επομένως δεν εμπλέκεται στην αλληλεπίδραση Zeocin-Mac1. Η πρωτεΐνη Cu/Zn δισμουτάση του υπεροξειδίου, Sod1, εντοπίζεται και στον πυρήνα και επηρεάζει μεταγραφικά, μεταξύ άλλων και γονίδια ρύθμισης της ομοιόστασης Cu/Fe (Tsang et al. 2014). Παρατηρήθηκε ότι η έλλειψη της πρωτεΐνης Sod1 έχει ως αποτέλεσμα την περαιτέρω μείωση της μεταγραφικής δράσης του Μac1 σε καλλιέργεια που αναπτύχθηκε σε πλούσιο θρεπτικό μέσο παρουσία του αντιβιοτικού Zeocin. Επομένως προτείνεται ότι, η επίδραση της Zeocin στον Μac1 γίνεται άμεσα μέσω του ιόντος χαλκού που ο Mac1 χρειάζεται για την πρόσδεσή του στο DNA και η Zeocin έχει αποβάλει για να δράσει στο DNA. Ο σχηματισμός ενός κατασταλτικού για τη μεταγραφή συμπλόκου περαιτέρω διαμορφώνεται από την παρουσία της Sod1 η οποία επίσης προσδένει ιόντα χαλκού. Η περαιτέρω μελέτη του προτεινόμενου μοντέλου έχει σημασία λόγω της ύπαρξης σημαντικών πρωτεϊνών που λειτουργούν με συμπαράγοντα τον χαλκό ή τον σίδηρο σε όλους τους οργανισμούς. (EL)
The presence of copper within living organisms is extremely important as a cofactor proteins and enzymes necessary for carrying out biological functions. In the yeast S. cerevisiae, a large number of genes of the proteins responsible for the reduction, introduction, distribution and storage of copper within the cell are transcribed by the protein Mac1 (Metal binding Activator). In cultures grown under DNA damage conditions using the antibiotic, radiomimetic Zeocin, it has been observed that the CTR1 gene, encoding a plasma membrane high-affinity copper transporter, exhibits significantly reduced levels of transcription. In parallel, iron-regulated genes are upregulated. In the present study, we confirmed that the Zeocin-dependent transcriptional reduction of CTR1 is due to the reduced functionality of the transcription factor, Mac1. Mac1 protein was detected quantitatively at similar levels in the presence or absence of Zeocin in the cells. Understanding the mechanism of the Zeocin effect in the transcription of specific genes is important due to the wide use of this drug as anticancer, antibiotic in cell cultures and radiomimetic for the study of DNA damage response. To clarify the reason Mac1 dysfunctionality in the presence of Zeocin, different approaches were used. We first examined RNA polymerase II recruitment on CTR1 gene and found reduced amounts of the protein on CTR1 promoter and coding region in cells cultured in the presence of Zeocin. This reduction is due to reduced levels of recruited Mac1 protein under the same conditions as seen by chromatin immunoprecipitation experiments. We then examined a potentially direct Zeocin-Mac1 interaction and found that the transactivation potential of the hybrid LexA-Mac1 was unaffected in the presence of Zeocin. Therefore, the drug does not interfere with the carboxy-terminal part of Mac1 that includes the transactivation domain. Moreover, Zeocin does not induce the intermolecular conformation known to inactivate the transcription function of Mac1. However, by using a strain expressing the constitutively active mutant Mac1up, we concluded that Zeocin affects the amino-terminal part of Mac1 protein. This region includes a Cu-fist involves in the binding of the protein to the target promoter DNA. We propose that copper ion in the Cu-fist region, that facilitates Mac1 binding on DNA under physiological conditions, reacts with the copper-chelating region of the Zeocin glycopeptide. The Zeocin –Mac1 complex has reduced capacity for binding to DNA and therefore transactivation of the Mac1-gene targets. We have also examined the possible involvement of proteins collaborating with Mac1 with roles in cell stress response. Rad9 protein, mediator of the DNA damage response signal, physically interacts with Mac1 and reduces its activity under physiological conditions (Gkouskou 2007). We found no additional effect in its absence on Mac1 reduced function in the presence of Zeocin. Therefore it has no role in the Zeocin-Mac1 interaction. The Cu / Zn superoxide dismutase Sod1 was recently found to localize also in the nucleus and affect the transcription of several genes including those regulating Cu/Fe homeostasis (Tsang et al. 2014). In the absence of Sod1 we found further reduction of CTR1 gene in rich medium cultures in the presence of Zeocin. Therefore, we propose that Zeocin affects Mac1 function by interacting directly with Cu-fist interfering with its DNA binding. The Zeocin-Mac1 complex is further modulated by Sod1 which also binds copper ions. Verification of the proposed model is quite important since many proteins use copper or iron ions as cofactors imperative for their function in all organisms. (EN)

text
Τύπος Εργασίας--Μεταπτυχιακές εργασίες ειδίκευσης

Μεταλλο-ρυθμιζόμενη μεταγραφή
Metal-regulated transcription

Πανεπιστήμιο Κρήτης (EL)
University of Crete (EN)

Greek

2015-11-20


Σχολή/Τμήμα--Σχολή Θετικών και Τεχνολογικών Επιστημών--Τμήμα Βιολογίας--Μεταπτυχιακές εργασίες ειδίκευσης



*Institutions are responsible for keeping their URLs functional (digital file, item page in repository site)