Οι ανοσορρυθμιστικές ιδιότητες των AF-MSCs(amniotic fluid-derived MSCs)

 
This item is provided by the institution :
University of Crete
Repository :
E-Locus Institutional Repository
see the original item page
in the repository's web site and access all digital files if the item*
share




2010 (EN)
The immunomodulatory properties of AF-MSCs
Οι ανοσορρυθμιστικές ιδιότητες των AF-MSCs(amniotic fluid-derived MSCs)

Μωυσίδου, Μαρία

Ανάγνου, Νικόλαος
Πανουτσακοπούλου Β.

Τα μεσεγχυματικά βλασικά κύτταρα είναι αρχέγονα πολυδύναμα κύτταρα με δυνατότητα διαφοροποίησης προς τις τρεις κυτταρικές σειρές του μεσοδέρματος (οστεογενής, λιπογενής και χονδρογενής). Μέχρι σήμερα, την πιο γνωστή πηγή μεσεγχυματικών βλαστοκυττάρων αποτελεί ο μυελός των οστών. Ωστόσο, τόσο η καλλιέργεια όσο και η διαδικασία απομόνωσης βλαστοκυττάρων από τον μυελό των οστών παρουσιάζει πολλά μειονεκτήματα και σημαντικούς περιορισμούς. Για το λόγο αυτό είναι ιδιαίτερα σημαντικό να εξεταστούνε νέες πηγές βλαστοκυττάρων. Μία πρόσφατη χαρακτηρισμένη πηγή μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων (MSCs) αποτελεί το αμνιακό υγρό (AF). Τα κύρια χαρακτηριστικά μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων του αμνιακού υγρού (AF-MSCs) είναι η εύκολη απομόνωση τους κατά την διάρκεια προγραμματισμένων αμνιοπαρακέντησεων, ο υψηλός ρυθμός προλλαπλασιαμού τους in vitro και η ικανότητα τους να διαφοροποιούνται προς οποιαδήποτε κυτταρική σειρά. Όλα αυτά τα χαρακτηριστικά καθιστούν τα AF-MSCs πολλά υποσχόμενα στην αναγεννητική ιατρική με στόχο την ανάπλαση ιστών και οργάνων. Παρόλα αυτά τα τελευταία χρόνια το ενδιαφέρον πολλών μελετών εστιάστηκε στην ιδιότητα των κυττάρων αυτών να καταστέλλουν το ανοσοποιητικό σύστημα. Αρκετοί ερευνητές μέχρι σήμερα έχουνε μελετήσει τις ανοσορυθμιστικές ιδιότητες των μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων που προέρχονται από ενήλικο ιστό, εντούτοις οι ιδιότητες των μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων που προέρχονται από εμβρυικούς ιστούς όπως το αμνιακό υγρό, παραμένουν άγνωστες. Επομένως, ο σκοπός αυτής της εργασίας είναι η μελέτη των ανοσορυθμιστικών ιδιοτήτων των AF-MSCs και η διερεύνηση των μηχανισμών που εμπλέκονται στις λειτουργίες αυτές. Αρχικός σκοπός της μελέτης είναι να εξετάσουμε την επίδραση των κυττάρων αυτών στον πολλαπλασιασμό των Τ λεμφοκυττάρων. Για το λόγο αυτό επιτελέστηκε συνκαλλιέργεια AF-MSCs και Τ λεμφοκυττάρων, τα οποία είχαν προηγουμένως ενεργοποιηθεί με μιτογονική ερέθισμα. Το αποτέλεσμα της πειρματικής αυτής διαδικασίας έδειξε την καταστολή του πολλαπλασιασμού των Τ λεμφοκυττάρων και 5 μάλιστα με δοσοεξαρτώμενο τρόπο παρουσία AF-MSCs. Πιο συγκεκριμένα παρατηρήθηκε οτι αυξανόμενος αριθμός AF-MSCs προκαλεί μεγαλύτερη καταστολή του πολλαπλασιασμού των Τ λεμφοκυττάρων. Ενδιαφέρον επίσης παρουσιάζει ότι τα AFMSCs δεν επηρεάζουν τον πολλαπλασιασμό των μη ενεργοποιημένων Τ λεφμοκύτταρων. Αυτό το γεγονός πιθανώς υποδηλώνει ότι τα AF-MSCs εκκρίνουνε διαλυτές ουσίες ή παράγοντες απαραίτητους για την επιβίωση των Τ λεμφοκυττάρων. Σε ένα επόμενο στάδιο εξετάσαμε εάν η καταστολή των Τ λεμφοκυττάρων οφείλεται μόνο στην έκκριση διαλυτών παραγόντων από τα κύτταρα ή ασκείται όταν οι δύο κυτταρικοί πληθυσμοί έρθουνε σε επαφή. Για αυτόν τον λόγο ενεργοποιημένα Τ λεμφοκύτταρα καλλιεργήθηκανε σε υπερκείμενο που απομονώθηκε από AF-MSCs και παρατηρήθηκε ότι το υπερκείμενο των AF-MSCs ήταν αδύνατο να καταστείλει τον πολλαπλασιασμό των ενεργοποιημένων Τ λεμφοκυττάρων υποδεικνύοντας ότι η κυτταρική επαφή είναι απαραίτητη για την κατασταλτική δράση των AF-MSCs. Αυτή η παρατήρηση έρχεται σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες σε MSCs που προέρχονται από τον μυελό τον οστών όπου υποστηρίζουνε ότι οι διαλυτοί παράγοντες που ευθύνονται για την καταστολή των Τ κυττάρων δεν εκκρίνονται συνεχώς από τα βλαστοκύτταρα (Beyth et al., 2005; Djouad et al., 2003; Maitra et al., 2004). ‘Επειτα εξετάσαμε εάν τα AF-MSCs καταστέλλουνε τα Τ λεμφοκύτταρα μέσω της κυτταρικής απόπτωσης. Ανάλυση της απόπτωσης των Τ κυττάρων με κυτταρομετρία ροής έδειξε ότι τα AF-MSCs επάγουν σημαντικά την αύξηση της έκφρασης Ανεξίνης V (Annexin V) στα ενεργοποιημένα Τ κύτταρα. Γιαυτό τον λόγο μελετήσαμε τα επίπεδα έκφρασης διαφόρων ανασταλτικών μορίων στα AF-MSCs όπως η ινδολεαμίνη (indoleamine), ένα μόριο όπου έχει θεωρηθεί αρκετές φορές υπεύθυνο για την καταστολή των Τ κυττάρων (Frumento et al., 2002; Tse et al., 2003). Πιο συγκεκριμένα παρατηρήθηκαν αρκετά αυξημένα επίπεδα έκφρασης της ινδολεαμίνης στα AF-MSCs που συνκαλλιεργούνται με ενεργοποιημένα Τ κύτταρα ως προς τα επίπεδα έκφρασης αυτού του μορίου στα AF-MSCs. Επιπρόσθετα μελετήσαμε διαφόρους μηχανισμούς που έχουνε προταθεί μέχρι τώρα ως πιθανοί μηχανισμοί καταστολής των Τ κυττάρων μέσω κυτταρικής επαφής με τα MSCs. Πρόσφατη μελέτη παρατήρησε ότι MSCs που εκφράζουνε χαμηλότερη έκφραση του δείκτη επιφανείας CD90 σε σύγκριση με MSCs που παρουσιάζουνε υψηλότερα επίπεδα έκφρασης έχουνε μικρότερη ανασταλτατική ικανότητα (Campioni et al., 2009). Στην δική μας μελέτη παρατηρήσαμε ότι AF-MSCs που συνκαλλιεργούνται με ενεργοποιημένα Τ κύτταρα ελλατώνουνε σημαντικά τα επίπεδα έκφρασης του δείκτη επιφανείας CD90, υποδεικνύοντας ότι τα AF-MSCs πιθανόν να χάνουνε την ικανότητα τους να αναστέλλουνε τα Τ κύτταρα με την πάροδου του χρόνου. Επιπρόσθετα, μετρηθήκανε τα επίπεδα έκφρασης του CD54 (ICAM-1) μορίου προσκόλλησης και διαπιστώθηκε ότι τα AF-MSCs που συνκαλλιεργούνται με τα ενεργοποιημένα Τ κύτταρα παρουσιάζουνε σημαντική αύξηση του CD54 σε σύγκριση με τα 6 AF-MSCs που δεν εκφράζουνε σχεδόν καθόλου αυτό το μόριο. Επομένως, ένας πιθανός μηχανισμός καταστολής των Τ κυττάρων που χρησιμοποιούνε τα AF-MSCs είναι η αύξηση του προσκολλητικού μορίου CD54 για να έρθουνε σε κυτταρική επαφή με τα ενεργοποιημένα Τ κύτταρα και ακολούθως να τα καταστείλουνε. Παρακάτω, σε αυτήν την εργασία μελετήθηκε ο ρόλος της αδενοσίνης στον μηχανισμό καταστολής των Τ λεμφοκυττάρων. Η αδενοσίνη είναι ένα αντιφλεγμονώδες μόριο που σε υψηλά επίπεδα έκφρασης επάγει την κυτταρική απόπτωση. Σε μία πρόσφατη εργασία παρατηρήθηκε ότι η αδενοσίνη παίζει σημαντικό ρόλο στον μηχανισμό που χρησιμοποιούνε τα Τ ρυθμιστικά κύτταρα (Tregs) για την καταστολή των Τ κυττάρων μέσω του μηχανισμού της απόπτωσης (Deaglio et al., 2007). Πιο συγκεκριμένα υποστηρίξανε ότι αυξημένα επίπεδα αδενοσίνης στον εξωκυττάριο χώρο προκαλούν την αυξημένη ενεργοποίηση του υποδοχέα της στα Τ κύτταρα (A2A receptor) και ακολούθως στην καταστολή των Τ κυττάρων. Παρόλα αυτά δεν υπάρχει προηγούμενη μελέτη για τον ρόλο της αδενοσίνης στον μηχανισμό καταστολής των Τ κυττάρων από τα MSCs. Στην συγκεκριμένη εργασία μελετήσαμε τα επίπεδα έκφρασης του δείκτη επιφανείας CD73 στα AF-MSCs και διαπιστώσαμε σημαντική αύξηση της έκφρασης του CD73 στα AF-MSCs που συνκαλλιεργούνται με ενεργοποιημένα Τ κύτταρα σε σύγκριση με τα AF-MSCs. Η CD73 είναι μία 5’εξωνουκλεάση που καταλύει τον σχηματισμό της αδενοσίνης και συμβάλλει στην έκκριση της αδενοσίνης στον εξωκυττάριο χώρο. Πιο συγκεκριμένα ο μηχανισμός που προτείνεται σε αυτήν την εργασία είναι ο εξής: τα αυξημένα επίπεδα του δείκτη επιφανείας CD73 στα AF-MSCs οδηγούνε στην αύξηση της εξωκυττάριας παραγωγής της αδενοσίνης, η οποία προσδένται στον υποδοχέα της (A2AR) στα Τ λεμφοκύτταρα. Επακόλουθα, η ενεργοποίηση του υποδοχέα της αδενοσίνης στα Τ κύτταρα οδηγεί στην καταστολή των Τ κυττάρων. Ωστόσο απαιτείται περαιτέρω μελέτη για να εξακριβώσουμε τον ακριβή μηχανισμό που παίζει ρόλο στην καταστολή των Τ κυττάρων. Τέλος σε αυτήν την μελέτη για πρώτη φορά γίνεται αναφορά στην επίδραση των ενεργοποιημένων Τ κυττάρων στην ανάπτυξη των AF-MSCs. Πιο συγκεκριμένα, μελετήθηκανε τα επιπεδα έκφρασης του υποδοχέα της αδενοσίνης (A2AR) στα AF-MSCs που συνκαλλιεργούνται με ενεργοποιημένα Τ κύτταρα και παρατηρήθηκαν σημαντικά αυξημένα επίπεδα του A2AR σε σύγκριση με τα AF-MSCs. Λαμβάνοντας υπόψιν μία προηγούμενη μελέτη σε MSCs όπου υποστηρίζει ότι η αύξηση των επιπέδων του A2AR αυξάνει την πολλαπλασιαστική ικανότητα των MSCs (Katebi et al., 2009), στην συγκεκριμένη εργασία προτείνετε ότι τα ενεργοποιημένα Τ κύτταρα πιθανόν να επηρεάζουνε την ανάπτυξη των μεσεγχυματικών κυττάρων μέσω της υπερέκφρασης του υποδοχέα της αδενοσίνης στην επιφάνεια τους όπου οδηγεί στην αύξηση του αριθμού των AF-MSCs. Συνοπτικά, λαμβάνοντας υπόψη ότι το αμνιακό υγρό αποτελεί μία εύκολα προσβάσιμη και πλούσια πηγή μεσεγυχματικών βλαστοκυττάρων, ο σκοπός της εργασίας αυτής είναι να εξετάσουμε τις ανοσορυθμιστικές ιδιότητες των κυττάρων αυτών έτσι ώστε τα 7 κύτταρα αυτά να μπορούνε να χρησιμοποιηθούνε μελλοντικά ως θεραπευτικά εργαλεία στην αναγγενητική ιατρική. (EL)
Mesenchymal stem cells (MSCs) constitute a population of multipotent adherent cells capable of differentiating into multiple lineages of the mesenchyme. To date, bone marrow represents the best characterized source of MSCs. However, BM-MSCs harvesting and processing exhibits major drawbacks and limitations. Thus alternative sources of MSCs is of great importance. A recently identified source of MSCs is the amniotic fluid (In 't Anker et al., 2004; Tsai et al., 2004). The main characteristics of the amniotic fluid-derived mesenchymal stem cells (AF-MSCs) are their ease of isolation during scheduled amniocentesis, their high expansion potential in vitro and their ability to differentiate into multiple lineages (Roubelakis et al., 2007). These characteristics make AF-MSCs ideal for use in several therapeutic applications. So far, extensive studies have shown that MSCs derived from adult tissues exert a profound inhibitory effect on T cell proliferation in vitro and in vivo. However, there is a limited number of studies describing the immunomodulatory properties of AF-MSCs (Roelen et al., 2009; Sessarego et al., 2008). Therefore, the purpose of this study is to elucidate the effect of AF-MSCs in lymphocyte proliferation and the molecular mechanisms that underlie this effect. In this study, was initially tested the effect of AF-MSCs on T cells and found that AF-MSCs inhibit T-cell proliferation triggered by mitogenic stimuli in a dose-dependent manner, but have no effect on resting / nonactivated T cells. Interestingly enough, AF-MSCs committed to differentiate into adipocytes exerted the same immunosuppressive effect to activated T cells. Furthermore, we aimed to elucidate whether the suppressive effects of AF-MSCs on activated T cells were contact-dependent or mediated through the release of soluble factors. For this reason activated T cells were cultured in the presence of AF-MSCs conditioned medium as described by Di Nicola (Di Nicola et al., 2002). Interestingly, soluble molecules from the culture supernatant of AF-MSCs failed to suppress activated T cells, indicating that cell-cell contact play major role in AF-MSCs mediated immunosuppression. Additionally, to determine whether AF-MSCs mediate their inhibitory effect through cell death, activated T cells that were in co-culture with AF-MSCs were analyzed by flow cytometry. Indeed, data reported that AF-MSCs inhibit T-cell proliferation by inducing apoptosis of activated T cells. Further studies showed that this apoptosis could be related to indoleamine (ido), an inhibitory molecule expressed in high levels in AF-MSCs when co-cultured with activated T cells. Additionally, in this study, CD90 (Thy-1) antigen and the adhesion molecule CD54 (ICAM-1) were found to play an important role in contact-mediated 4 suppression of the immune system. More importantly, we introduced, for the first time, the role of adenosine in AF-MSCs mediated T-cell suppression. In particular, the increased expression levels of the surface molecule CD73 (5’ectonucleotidase) in AF-MSCs suggested that this might be responsible for the elevated levels of adenosine production extracellularly and in this way mediated T-cell suppression. In the present work, it is described, for the first time, the effect of activated T cells on AF-MSCs development. To conclude, taking into consideration that amniotic fluid constitutes an easily accessible and rich source of MSCs, the aim of this study was to elucidate the immunomodulatory properties of AF-MSCs in order to establish AFMSCs as a safe and effective therapeutic tool in regenerative medicine. (EN)

text
Τύπος Εργασίας--Μεταπτυχιακές εργασίες ειδίκευσης

Amniotic fluid
Αμνιακό υγρό
Biochemistry
Μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα
Mesenchymal stem cells

Πανεπιστήμιο Κρήτης (EL)
University of Crete (EN)

Greek

2010


Σχολή/Τμήμα--Ιατρική Σχολή--Τμήμα Ιατρικής--Μεταπτυχιακές εργασίες ειδίκευσης



*Institutions are responsible for keeping their URLs functional (digital file, item page in repository site)