Heterologous biosynthesis of plant flavonoids from SACCHAROMYCES CEREVISIAE targeting their exrloitation in phytoprotection of grapeving and wine making

 
This item is provided by the institution :
University of Crete
Repository :
E-Locus Institutional Repository
see the original item page
in the repository's web site and access all digital files if the item*
share



PhD thesis (EN)

2009 (EN)
Ετερόλογη βιοσύνθεση φυτικών φλαβονοειδών από το σακχαρομύκητα SACCHAROMYCES CEREVISIAE για την αξιοποίηση τους στην φυτοπροστασία της αμπέλου και στην οινοποίηση.
Heterologous biosynthesis of plant flavonoids from SACCHAROMYCES CEREVISIAE targeting their exrloitation in phytoprotection of grapeving and wine making

Τραντάς, Εμμανουήλ

Αλεξανδράκη, Δέσποινα
Πανόπουλος, Νικόλαος
Βερβερίδης, Φίλιππος

Οι (πολυ)φαινολικές ουσίες είναι μια σημαντική κατηγορία φυτικών συστατικών που εμπλέκονται στο διατροφικό μενού του ανθρώπου. Οι ουσίες αυτές αποτελούν μια πολυσύστατη ομάδα με βιολογικώς δραστικές μη-θρεπτικές ενώσεις. Μεταξύ αυτών, τα λαβονοειδή και τα στιλβενοειδή παρουσιάζουν εξαιρετικό ενδιαφέρον, με τα πρώτα να αποτελούνται από ενώσεις με συναφή χημική δομή, με την έννοια ότι στηρίζονται στον ίδιο C6-C3-C6 σκελετό, προερχόμενα από το βιοσυνθετικό μονοπάτι των φαινυλοπροπανοειδών. Ο όρος «φλαβονοειδή» χρησιμοποιείται για να συμπεριλάβει τρεις τάξεις συναφών δομικά ομάδων ενώσεων που απορρέουν από μια αντίδραση συμπύκνωσης ενός «ενεργοποιημένου» υδροξυ-κινναμικού οξέος (φαινυλοπροπανοειδές) με το μηλόνυλο-CoA, τα κύρια φλαβονοειδή, τα ισοφλαβονοειδή και τα νεοφλαβονοειδή. Από την άλλη πλευρά, τα στιλβενοειδή είναι ενώσεις που προέρχονται από μια παρόμοια αντίδραση συμπύκνωσης, αλλά με την διαμεσολάβηση ενός εξελικτικά διαφοροποιημένου ενζύμου. Η εξέχουσα σημασία των φλαβονοειδών και των στιλβενοειδών πηγάζει από το γεγονός ότι εμπλέκονται σε πολλές λειτουργίες της φυσιολογίας των φυτών, όπως τον χρωματισμό των ιστών, την ανθεκτικότητα ενάντια σε μικρόβια και έντομα, τις αλληλεπιδράσεις με άλλους οργανισμούς, την προστασία από την υπεριώδη ακτινοβολία, την μετάδοση και απόκριση σε ερεθίσματα του περιβάλλοντος, την βλάστηση της γύρης και την ενεργό μεταφορά αυξινών. Επιπλέον, τα συστατικά αυτά, όπως αποδείχθηκε πρόσφατα, έχουν εξαιρετικά υψηλή φαρμακολογική αξία. Οι φλαβονοειδείς ενώσεις διαθέτουν αντι-οξειδωτικές, αντι-φλεγμονώδεις, αντι-μικροβιακές, αντι-καρκινικές ιδιότητες όπως επίσης μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την καταπολέμηση αλλεργιών, για την καταστολή μετα- εμμηνοπαυσιακών συμπτωμάτων και καρδιαγγειακές θεραπείες. Επίσης, υπάρχει θετική συσχέτιση μεταξύ της πρόσληψης φλαβονοειδών και της μείωσης του κινδύνου για πρόκληση στεφανιαίας νόσου, εγκεφαλικών επεισοδίων και πολλών ειδών καρκίνου όπως έχει αποδειχθεί μέσα από πολυάριθμες επιδημιολογικές μελέτες. Πολλοί από τους δευτερογενείς μεταβολίτες που κατέχουν τις προαναφερθείσες ιδιότητες παράγονται από τα φυτά σε μικροποσότητες ή είναι δύσκολη η επεξεργασία και απομονωσή τους. Το ενδιαφέρον για την αξιοποίηση των ιδιοτήτων αυτών των δευτερογενών μεταβολιτών σε τομείς όπως η φαρμακοβιομηχανία, η ανθρώπινη υγεία, η γεωπονία (π.χ. βιολογική και ολοκληρωμένη φυτοπροστασία), έχει αυξήσει την ανάγκη για την ετερόλογη βιοσύνθεση των ουσιών που έχουν ή θεωρείται ότι έχουν επωφελείς ιδιότητες, όπως είναι τα φλαβονοειδή και τα στιλβενοειδή. Το κουμαρικό οξύ1, ένα φαινολικό οξύ, η ρεσβερατρόλη2, ένα στιλβενοειδές, η ναριγκενίνη3, μια φλαβανόνη, η γενιστεΐνη, μια ισοφλαβόνη και οι φλαβονόλες καμφερόλη και κερκετίνη, έχει αποδειχθεί ότι ανήκουν σε ουσίες με υψηλή διατροφική και αγρονομική αξία. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή κατασκευάστηκαν έξι κατάλληλα γενετικά τροποποιημένα στελέχη σακχαρομύκητα (Saccharomyces cerevisiae) τα οποία φέρουν πλασμίδια με όλα τα απαραίτητα γονίδια που επιτρέπουν τη αντίστοιχη βιοσύνθεση των προαναφερόμενων ουσιών μέσω βιο-μετατροπής της φαινυλαλανίνης. Τα μεταγραφικώς ενεργά, για τα ετερόλογα διαγονίδια, στελέχη σακχαρομύκητα χρησιμοποιήθηκαν για την ποσοτικοποίηση των πρόδρομων ουσιών και των τελικών προϊόντων, επιβεβαιώνοντας την παραγωγή 108,6mg/L κουμαρικού οξέος, 0,29-0,31mg/L ρεσβερατρόλης, 8,9-15,6mg/L ναριγκενίνης, 0,1-7,7mg/L γενιστεΐνης, 0,9-4,6mg/L καμφερόλης και 0,26-0,38mg/L κερκετίνης στα θρεπτικά μέσα ανάπτυξης, ανάλογα πάντα με την πρόδρομη ένωση που χρησιμοποιήθηκε. Επίσης, καταβλήθηκε προσπάθεια βελτιστοποίησης των παραμέτρων που εμπλέκονται στα μονοπάτια της ετερόλογης βιοσύνθεσης των προαναφερθέντων ουσιών. Μελετήθηκε ιδιαίτερα η δυνατότητα της επιλογής της πρόδρομης ουσίας για την μέγιστη παραγωγή τελικού προϊόντος, τα επίπεδα αρχικού μολύσματος, καθώς και η ροή της σύνθεσης ουσιών στα ενδιάμεσα βιοσυνθετικά βήματα κάθε τελικού προϊόντος. Τέλος, στη συζήτηση αναφέρονται τα πλεονεκτήματα και τα αδύνατα σημεία της ετερόλογης σύνθεσης φλαβονοειδών ουσιών από το σακχαρομύκητα με ανάλυση των δυνατοτήτων εφαρμογής/ χρήσης τους στη βιομηχανία ποτών (Οινοποιία) και στην φυτοπροστασία (ολοκληρωμένη διαχείριση καλλιεργειών). (EL)
In addition to many essential nutritional components, plants contain (poly)phenolic substances that comprise a large and heterogeneous group of biologically active non-nutrient compounds. Among them flavonoids and stilbenoids are of exceptional interest, with the former consisting of a diverse array of structurally related compounds possessing the same C6-C3-C6 backbone skeleton, derived from the phenylpropanoid biosynthetic pathway. The term “flavonoids” is used to include the three classes of structurally related compounds deriving from the condensation reaction of an activated hydroxy-cinnamic acid (phenylpropanoid) with malonyl-CoA, main flavonoids, isoflavonoids and neoflavonoids. On the other hand stilbenoids are compounds derived by a similar condensation reaction but with the participation of an evolutionarily diverged enzyme. The significance of flavonoids and stilbenoids derives from the fact that they are involved in aspects of plant physiology such as tissue pigmentation, defence against microbes or insects, interactions with other organisms, protection against UV irradiation, transmission and response to specific environmental stimuli, pollen germination and active auxin transfer. Moreover these compounds, as found recently, have also high pharmacological value. Flavonoids have long been recognised to possess anti-oxidant, anti-inflammatory, antimicrobial, anti-proliferative, anti-allergenic activities and acting as post-menopausal and cardiovascular cures. Inverse relationships between the intake of flavonoids and the risk of coronary heart disease, stroke and many types of cancer have been shown by epidemiological studies. A plethora of secondary metabolites with such exceptional properties are produced through plant’s metabolic machinery in traceable quantities or are extremely difficult to extract or process them. The interest for the exploitation of these metabolite properties by the pharmaceutical or agricultural industry (biological or integrated crop protection) and medicine has increased the need for heterologous biosynthesis of substances that are assumed or proven to possess beneficial actions, such as the flavonoids and stilbenoids. Coumaric acid, a phenolic acid, resveratrol, a stilbenoid, naringenin, a flavanone, genistein, an isoflavone, and flavonols kaempferol and quercetin have been shown to be substances with potential nutritional and agricultural value. In this doctoral dissertation, six metabolically engineered yeast (Saccharomyces cerevisiae) strains harbouring plasmids with all the necessary genes that permit the biosynthesis of the abovementioned compounds, utilizing phenylalanine as a precursor, have been constructed. Yeast strains with transcriptionally active heterologous genes, were used to construct time courses showing the dependence of the precursor utilization and the quantification of the respective end-product synthesis. Thus it has been demonstrated the production of 108,6mg/L of coumaric acid, 0,29-0,31mg/L of resveratrol, 8,9-15,6mg/L of naringenin, 0,1-7,7mg/L of genistein, 0,9-4,6mg/L of kaempferol and 0,26-0,38mg/L of quercetin in culture media, with respect to the precursor molecule that has been tested. Moreover, experiments were performed to optimize the parameters involved in the heterologous biosynthetic pathways. Especially, the optimal concentration of the precursor molecule was studied as well as the relevance of starting inoculum at the end-product concentration. Furthermore, the fluxes through the intermediate nodes of the pathways were studied. Finally, the advantages and disadvantages of the use of yeast are discussed as being a host for the heterologous production of flavonoids and stilbenoids and the kind of their potential uses in wine and agricultural (phytoprotection) industry. (EN)

Τύπος Εργασίας--Διδακτορικές διατριβές
text

Στιλβενοειδή
Φλαβονοειδή
Metabolic engineering
Μεταβολική μηχανική
Stilbenoids

Πανεπιστήμιο Κρήτης (EL)
University of Crete (EN)

Greek

2009-05-28


Σχολή/Τμήμα--Σχολή Θετικών και Τεχνολογικών Επιστημών--Τμήμα Βιολογίας--Διδακτορικές διατριβές



*Institutions are responsible for keeping their URLs functional (digital file, item page in repository site)