Θεωρητικο υπόβαθρο: Η γλουταμική αφυδρογονάση, ένα ένζυμο που υπάρχει σε διάφορους ιστούς θηλαστικών, καταλύει την αναστρέψιμη αντίδραση απαμίνωσης του γλουταμικού σε α-κετογλουταρικό και αμμωνία. Δύο ισομορφές γλουταμικής αφυδρογονάσης απαντώνται στον άνθρωπο, η hGDH1 και η hGDH2, αντιστοίχως. Η hGDH1 είναι ένζυμο που εκφράζεται σε όλα τα κύτταρα του ανθρώπινου οργανισμού. Απεναντίας, η hGDH2 μέχρι στιγμής έχει εντοπιστεί σε κύτταρα του εγκεφάλου, όρχεων και νεφρών. Χαρακτηριστικό των δύο ισο-ενζύμων είναι η αλλοστερική ενεργοποίηση από ADP και λευκίνη καθώς και η αναστολή της δράσης τους από την παρουσία GTP. Οι γλουταμικές αφυδρογονάσες συμβάλλουν σε σημαντικές κυτταρικές λειτουργίες καθώς συνδέουν το μεταβολισμό των υδατανθράκων με αυτόν των αμινοξέων, ρυθμίζουν τον μεταβολισμό του γλουταμικού ως νευροδιαβιβαστή και την έκκρισης ινσουλίνης, και τέλος, συμμετέχουν στην παραγωγή ενέργειας και την ομοιόσταση της αμμωνίας. Προηγούμενες μελέτες έχουν αποδείξει ότι τα ένζυμα αυτά εντοπίζονται στη μήτρα των μιτοχονδρίων.
Στόχοι της μελέτης: Οι στόχοι της μελέτης είναι δύο, ο πρώτος να επιβεβαιωθεί η υποκυτταρική συνεντόπιση των hGDH1 και hGDH2 και ο δεύτερος να μελετηθεί το αποτέλεσμα της υπερέκφρασης hGDH1 και hGDH2 σε κυτταρικές σειρές.
Μέθοδοι: Ως προς τον πρώτο στόχο της παρούσας μελέτης, έγινε ιχνηθέτηση των ενζύμων με διαφορετικών χρωμάτων φθορίζουσες πρωτεΐνες, ώστε να επιβεβαιωθεί η υποκυτταρική τους συνεντόπιση. Ως προς τον δεύτερο στόχο της μελέτης, έγινε δημιουργία κυτταρικών σειρών HEK293 που υπερεκφράζουν είτε hGDH1 είτε hGDH2, ώστε στη συνέχεια να μελετηθεί ο αντίστοιχος φαινότυπος.
Αποτελέσματα: Τα πειραματικά αποτελέσματα των μελετών μας σχετικά με τον εντοπισμό των δύο ανθρώπινων γλουταμικών αφυδρογονασών υποδηλώνουν ότι τα ένζυμα αυτά συνεντοπίζονται υποκυτταρικά εντός των μιτοχονδρίων. Συγκεκριμένα, έπειτα από ιχνηθέτηση της hGDH1 με πράσινο χρώμα και της hGDH2 με κόκκινη φθορίζουσα πρωτεΐνη, επιβεβαιώνεται σύμφωνα με τη διακριτική ικανότητα του μικροσκοπίου που χρησιμοποιήθηκε ότι συνεντοπίζονται στα μιτοχόνδρια. Επίσης, σύμφωνα με τα πειράματα που πραγματοποιήθηκαν για το φαινοτυπικό χαρακτηρισμό των κυτταρικών σειρών που δημιουργήθηκαν, τα αποτελέσματά μας υποδηλώνουν ότι τα κύτταρα HEK293 που υπερεκφράζουν είτε hGDH1 είτε hGDH2 εμφανίζουν μειωμένα ποσοστά νεκρών κυττάρων σε διάφορα στάδια της ανάπτυξης τους σε καλλιέργεια. Συγκεκριμένα, το ποσοστό νεκρών κυττάρων που αναγνωρίστηκαν στην καλλιέργεια 24 ώρες μετά την σπορά των κυττάρων, ήταν περίπου 35% στα αγρίου τύπου κύτταρα, ενώ στις κυτταρικές σειρές που
5
υπερεκφράζουν hGDH1 και hGDH2 ήταν 10-15% (p value<0,0001) και 5–15% (p value<0,0001), αντιστοίχως.
Συμπέρασματα: Συμπερασματικά, τα πειραματικά μας αποτελέσματα δείχνουν υποκυτταρική συνεντόπιση hGDH1 και hGDH2, και σημαντικό ρόλο και των δύο στην κυτταρική ανάπτυξη. Τα αποτελέσματα αυτά χρειάζεται να αναλυθούν και να διερευνηθούν εκτενέστερα, ώστε να εξακριβωθεί ο ρόλος των ανθρώπινων ισοενζύμων γλουταμικής αφυδρογονάσης στην κυτταρική λειτουργία και βιωσιμότητα.
(EL)
Background: Glutamate dehydrogenases catalyze the reversible deamination of L-glutamate to a-ketoglutarate and ammonia. Two isoforms of glutamate dehydrogenases are found in humans, namely hGDH1 and hGDH2. hGDH1 is expressed in almost every human cell (housekeeping enzyme). On the other hand, hGDH2 has been found mainly in brain, testis and kidneys. Both enzymes are allosterically activated by ADP and L-leucine and inhibited by GTP. They contribute to important cellular processes as they interconnect amino acid and carbohydrate metabolism, mediate neurotransmitter recycling and play important role in energy production, ammonia management and insulin secretion. Previous studies have indirectly proven that both enzymes are located in mitochondria matrix.
Aim of the study: The present study is divided in two main complementary objectives. The first objective is to determine whether the two isoenzymes are co-localized subcellularly. The second objective is to study the result of the over expression of hGDH1 and hGDH2 in mammalian cell lines.
Methods: For answering our first scientific question, we tagged each iso-enzyme with fluorescent protein of different colour, so that we could detect them subcellularly using confocal microscopy. For the second objective, we created stable HEK293 cell lines over expressing either hGDH1 or hGDH2 in order to study their phenotypic characteristics.
Results: Experiments related to subcellular localization, revealed that the two enzymes are co-localized inside mitochondrial matrix. Specifically, after tagging hGDH1 with GFP and hGDH2 with RFP, it was confirmed, as far as the resolution of our confocal microscope permitted, that they co-localize inside the mitochondrial matrix. Moreover, characterization experiments showed that stable HEK293 lines over expressing hGDH1 or hGDH2, respectively, display lower death rates in different time points of their lifespan as compared to wild-type cells. Specifically, mainly in exponential growth phase (24h after plating), WT HEK293 exhibit more dead cells (approximately 35%) compared to stable cell lines over expressing hGDH1 and hGDH2 (10-15%; p<0.0001 and 5-15%; p <0.0001, respectively).
Conclusions: In conclusion, our experimental results suggest subcellular co-localization of hGDH1 and hGDH2, as well as major contribution of both iso-enzymes in cell growth and lifespan. These data need to be further analyzed and followed by additional studies for deciphering the role of hGDHs in cell viability and function.
(EN)
