Το διαμέρισμα μεταξύ της εξωτερικής και της εσωτερικής μεμβράνης των μιτοχονδρίων που ονομάζεται διαμεμβρανικός χώρος (IMS) φέρει πολλές διαφορετικές πρωτεΐνες που περιέχουν δισουλφιδικούς δεσμούς στη δομή τους. Πρόσφατα, ένα σύστημα οξειδοαναγωγής δισουλφιδίων στον διαμεμβρανικό χώρο έχει ταυτοποιηθεί στο οποίο παίζουν σημαντικό ρόλο δύο ζωτικής σημασίας πρωτεΐνες, η σουλφυδριλοξειδάση Erv1 και ο υποδοχέας εισόδου πρωτεϊνών-υποστρωμάτων που ρυθμίζεται οξειδοαναγωγικά, Mia40/Tim40. Αυτό το σύστημα οξειδοαναγωγής, που ονομάζεται Mia40-Erv1 μονοπάτι, οδηγεί την είσοδο πλούσιων σε κυστεϊνες πρωτεϊνών στο IMS των μιτοχονδρίων μέσω ενός μηχανισμού οξειδωτικής αναδίπλωσης.
Στην παρούσα εργασία, στόχος ήταν η εύρεση πιθανών νέων υποστρωμάτων της οξειδάσης σουλφυδριλίων Erv1, η οποία όπως προαναφέρθηκε βρίσκεται στο διαμεμβρανικό χώρο των μιτοχονδρίων του σακχαρομύκητα Saccharomyces cerevisiae. Με την πραγματοποίηση βιοχημικών πειραμάτων, όπως χρωματογραφία αποκλεισμού μεγέθους και πρόσδεσης της πρωτεΐνης αυτής ως σημασμένη με ιστιδίνες στο καρβοξυτελικό της άκρο, σε σφαιρίδια νικελίου, δείχνουμε ότι το σύμπλοκο το οποίο φαίνεται να απομονώνεται από τα μιτοχόνδρια του στελέχους Erv1His του σακχαρομύκητα είναι μοριακού βάρους περίπου 70kDa. Αυτό το μοριακό βάρος είναι πιθανό να αφορά το διμερές της Erv1 ή κάποιο σύμπλοκο αυτής με μια πρωτεΐνη παρόμοιου μοριακού μεγέθους καθώς από τα πειραματικά δεδομένα δεν φαίνεται να περιλαμβάνει τις πρωτεΐνες Mia40 και κυτόχρωμα c (cytc), δύο πρωτεΐνες οι οποίες αλληλεπιδρούν με την Erv1 πρωτεΐνη. Παράλληλα, έγινε μια προσπάθεια ποσοτικοποίησης των πρωτεϊνών Erv1, Mia40 και κυτόχρωμα c σε μιτοχόνδρια αγρίου τύπου του σακχαρομύκητα κάτω από φυσιολογικές συνθήκες. Το αποτέλεσμα έδειξε ότι ενώ το κυτόχρωμα c φαίνεται να βρίσκεται σε μεγαλύτερη ποσότητα ανά mg μιτοχονδρίων συγκριτικά με τις άλλες δύο πρωτεΐνες, η πρωτεΐνη Mia40 φαίνεται να υπάρχει σε υποστοιχειομετρική ποσότητα συγκριτικά με την πρωτεΐνη Erv1, η οποία είναι γνωστό ότι οξειδώνει την Mia40 ανακυκλώνοντάς την με αυτόν τον τρόπο. Ακόμα, μελετήσαμε την αλληλεπίδραση των πρωτεϊνών Erv1 και Mia40 σε δύο στάδια: κατά την είσοδο της πρωτεΐνης Erv1 ως υπόστρωμα της πρωτεΐνης Mia40 και σε ένα δεύτερο στάδιο την αλληλεπίδρασή τους από τη στιγμή ix
που η Erv1 αναδιπλωθεί στο διαμεμβρανικό χώρο του μιτοχονδρίου και γίνει λειτουργική. Φαίνεται ότι κάποια υδρόφοβα αμινοξέα στη καρβοξυτελική πλευρά του κυστεϊνικού μοτίβου CRSC της αγρίου τύπου Erv1 του σακχαρομύκητα (yErv1) είναι σημαντικά για το σχηματισμό του “Μia40-Εrv1” μικτού δισουλφιδικού ενδιάμεσου ενώ δεν είναι σημαντικά για την είσοδο της πρωτεΐνης αυτής ως υπόστρωμα στο διαμεμβρανικό χώρο και επομένως την αναγνώρισή της από την πρωτεΐνη Mia40. Τέλος, προσπαθήσαμε να δουλέψουμε με το ανθρώπινο ορθόλογο της Erv1, την πρωτεΐνη hALR, η οποία έχει δύο ισομορφές την μεγάλου μήκους (long form, lf) και τη μικρού μήκους (short form, sf). Πολλά από τα εργαλεία δουλειάς για τη μελέτη των συγκεκριμένων πρωτεϊνών σε μιτοχόνδρια του σακχαρομύκητα έχουν στηθεί για την απάντηση πολλών και σημαντικών ερωτημάτων σε αυτό το ετερόλογο σύστημα.
(EL)
The place between the inner and outer membrane of mitochondria, which is called intermembrane space (IMS), possess a number of many and different proteins that have disulfide bonds in their structure. Recently, a disulfide oxidative system in the intermembrane space has been identified in which two proteins, sulfhydryl oxidase Erv1 and the import receptor of proteins-substrates that is redox regulated, Mia40/Tim40 have a crucial role. This redox system, which is called Mia40-Erv1 pathway, drives the import of proteins that are rich in cysteines into IMS of mitochondria through a mechanism of oxidative folding.
In the present study, the aim was the finding of possibly new substrates of sulfhydryl oxidase Erv1, which is located in the intermembrane space of mitochondria of yeast Saccharomyces cerevisiae. By biochemical experiments, like gel filtration and binding of this protein as histidin-tagged at its carboxyl terminal end, on nickel beads, we show that the complex that is appeared to be isolated from the mitochondria of Erv1His strain of yeast has approximately 70kDa molecular weight. This molecular weight may refers to the Erv1 dimer or a complex between Erv1 and a similar molecular weight protein with, as from the experimental data it does not seem to conclude the proteins Mia40 and cytochrome c (cytc), two proteins that interact with Erv1 protein. In parallel, an effort to quantify the proteins Erv1, Mia40 and cytochrome c in wild type mitochondria took place under steady state conditions. The result showed that while cytochrome c seems to appear in a bigger quantity per mg of mitochondria compared to the other two proteins, the protein Mia40 seems to exist in substoichiometric amounts of Erv1, which is known to oxidize Mia40 and therefore recycling it. Moreover, we studied the interaction of the Erv1 and Mia40 in two steps: during the import of Erv1 protein as a substrate of Mia40 protein and in a second way the interaction between them when Erv1 has been folded into the intermembrane space of yeast mitochondria and has been functional. It seems like some hydrophobic residues that are downstream of the cysteine motif CRSC of wild type Erv1 (yErv1) are very important for the formation of the “Μia40-Εrv1” mixed disulfide bonded intermediate while they are not important for the import of this protein as a substrate and therefore for its recognition by Mia40 protein. In the end, we tried to work on human ortholog of Erv1, the protein hALR, that has two isoforms: the long form (lf) and short form (sf). Many of the tools for the study of these specific proteins in yeast mitochondria are ready to answer many and important questions in this heterologous system.
(EN)
