Ο παραδοσιακός τρόπος σκέψης που αφορά τη γονιδιακή ρύθμιση, αναθεωρήθηκε από τη σχετικά πρόσφατη ανακάλυψη των micro-RNAs και των siRNAs (small interfering RNAs), τάξεις μικρών (19-25 νουκλεοτιδίων) RNAs που παίζουν ρόλο στη μετα-μεταγραφική ρύθμιση μέσω συστατικών του RNAi μονοπατιού (RNA interference) (1). H ρύθμιση αυτή πραγματοποιείται είτε με απευθείας στόχευση των αγγελιοφόρων μορίων RNA και ακόλουθη αποδόμησή τους ή με αναστολή της διαδικασίας της μετάφρασης (2, 3, 4). Αρχικά, η ανακάλυψη των miRNAs, στηρίχθηκε στην κλωνοποίηση και στην αλληλούχιση μικρών μορίων RNA, που η πρωταρχική τους διαμόρφωση κατά την μεταγραφή εμφάνιζε μια ιδιαίτερη δομή, δομή φουρκέτας. Μια τέτοια δομή αποτελεί πρόδρομο για το τελικό miRNA μόριο (5). Στη συνέχεια αναπτύχθηκαν αρκετά αποτελεσματικές υπολογιστικές μέθοδοι που είχαν και έχουν την ικανότητα να ανακαλύπτουν πιθανά miRNAs με βάση διάφορα επιμέρους χαρακτηριστικά (διαμόρφωση φουρκέτας, συντήρηση μεταξύ των οργανισμών κα) (6, 12, 51). Εκατοντάδες miRNAs έχουν ανακαλυφθεί σε ευκαρυωτικούς οργανισμούς, γεγονός που υποδεικνύει ότι η ειδική αυτή κατηγορία των RNAs συμβάλλει στην πολυπλοκότητα της γονιδιακής ρύθμισης των οργανισμών μέσω ενός τεράστιου δικτύου ρυθμιστικών αλληλεπιδράσεων. Παρά το γεγονός όμως ότι μεγάλος αριθμός από πιθανά miRNAs έχουν προβλεφθεί στο εσωτερικό των γονιδιωμάτων, ένα ποσοστό μόνο από αυτά έχει επιβεβαιωθεί ότι μεταγράφονται σαν miRNAs και ακόμα λιγότερα έχουν επιβεβαιωμένα γονίδια στόχους και εξακριβωμένη βιολογική λειτουργία (2, 3, 17, 18). Η ανάγκη για επιβεβαίωση της ύπαρξης συγκεκριμένων miRNA μορίων στο εσωτερικό των ευκαρυωτικών οργανισμών με βάση τα αποτελέσματα πρόβλεψης των μέχρι τώρα υπολογιστικών μεθόδων, οδήγησε στην τροποποίηση μιας ήδη υπάρχουσας τεχνικής, που μπορεί να οδηγήσει στην άμεση ανακάλυψη συγκεκριμένων miRNAs στο εσωτερικό των οργανισμών με μεγάλη ευαισθησία, παρακάμπτοντας το μεγάλο χρονικό διάστημα που απαιτείται για την πραγματοποίηση του συγκεκριμένου στόχου με τη χρήση γνωστών τεχνικών (Northern) (7). Η τεχνική αυτή βασίζεται στην πραγματοποίηση ισόθερμων αντιδράσεων με τελικό αποτέλεσμα την ενίσχυση του σήματος κάποιου miRNA με τη μορφή 12-νουκλεοτιδίων (12-mers). H σταθερότητα, η ταχύτητα και η ευαισθησία του συστήματος, πιθανώς να την καταστήσουν ένα αναπόσπαστο εργαλείο στην ανακάλυψη και γενικότερα στη μελέτη miRNAs σε ένα ευρύ φάσμα ευκαρυωτικών οργανισμών. Σημαντικό πλεονέκτημα της μεθόδου μπορεί να αποτελέσει η ικανότητα ποσοτικοποίησης των εκάστοτε μη κωδικοποιών RNAs. Μια εναλλακτική προσέγγιση για την ανίχνευση GFP siRNAs από εκχυλίσματα φυτών, αναπτύχθηκε επίσης στο εργαστήριο. Η τεχνική αυτή στηρίζεται στην ικανότητα της T7 RNA πολυμεράσης να μεταγράφει ανεξάρτητα της παρουσίας υποκινητή σε μήτρα DNA, παρουσία κατάλληλων εκκινητών, σχηματίζοντας υβρίδια DNA-RNA (8, 9). Τα siRNAs είναι μόρια με χημική συγγένεια όσον αφορά τα miRNAs, τα οποία εμπλέκονται σε μονοπάτια γονιδιακής ρύθμισης και προστασίας των οργανισμών (10, 11). Επίσης τα τελευταία συμμετέχουν σε επιγενετικές τροποποιήσεις των ιστονών και του DNA οδηγώντας σε μεταγραφική σίγηση (13, 14). Ταυτόχρονα, στο εργαστήριο κλωνοποιήθηκαν κατασκευές που φέρουν το γονίδιο της GFP πρωτεΐνης με θέση πρόσδεσης για το mi399 στην Arabidopsis στο εσωτερικό της αλληλουχίας τους (15, 16). Η μεταφορά σε φυτά (αγροεμποτισμός) με τη χρήση κατάλληλων κατασκευών ελέγχου (controls) μπορεί να δώσει πληροφορίες όχι μόνο αν το συγκεκριμένο microRNA υπάρχει στο γένωμα, αλλά και αν έχει ενεργό ρόλο στη σίγηση γονιδίων μέσω κάποιου τύπου μετα-μεταγραφικής παρέμβασης.
(EL)
Traditional thinking regarding gene regulation was shaken by the recent discovery of microRNAs, an abundant class of small, endogenous RNAs (19-25 nucleotides) that mediate post transcriptional regulation via components of the RNA-interference (RNAi) pathway (1), either by directing target transcript cleavage or by translational inhibition (2, 3, 4). Early microRNA discovery relied upon cloning and sequencing of small RNAs to find those whose primary configuration during transcription adopted a special hairpin structure; such a structure is an obligate precursor to the mature miRNA (5). Effective computational methods were later developed that are capable of discovering potential microRNAs based on different traits (hairpin structure, conservation among eukaryotes etc) (6, 12, 51). Hundreds of microRNAs have been discovered in complex eukaryotes, implying that this specific class mediates a vast network of unappreciated regulatory interactions, contributing to the complexity of gene regulation in higher organisms. Despite that hundreds of potential microRNAs have been predicted within the species, a small percentage seems to be indeed transcribed and a negligible number of them have known in vivo functions and biologically relevant target genes (2, 3, 17, 18). The need for substantiation of particular miRNΑs in the eukaryotes based on the output of the up-to-now computational approaches, led to the amendment of a technique that can lead to the imminent discovery of certain miRNAs with great sensitivity leaving behind time-consuming approaches (Northern technique) (7). This particular technique comprises a class of isothermal reactions that eventually lead to signal amplification of a particular miRNA, indirectly, in the form of 12-mers. The robustness, speed and sensitivity of the system may render the isothermal technique an indispensable tool for the discovery and the study of miRNAs in a broad spectrum of eukaryotic organisms. An important asset of this technique respectively, may as well be the quantification of the non-coding RNAs. An alternative approach for tracing small regulatory RNAs was developed in the lab. This approach led to the discovery of GFP siRNAs in cell extracts. siRNAs are chemically similar to miRNAs. They are implicated in gene regulation pathways, as well as protection from invasive genetic material (10, 11). Moreover, siRNAs participate epigenetic modifications of histones and DNA leading to transcriptional silencing (13, 14). This particular technique is based on the flexibility of theΤ7 polymerase to transcribe promoter-less templates, extending primers, eventually leading to the formation of DNA-RNA hybrids (8, 9). On the other hand, constructs that contain the GFP gene with binding site for miR399 (15, 16) in Arabidopsis, were cloned. Subsequent agroinfiltrations with the use of appropriate controls can provide information, not only for the presence of this particular RNA in the genome, but whether it has an active role in gene silencing through posttranscriptional interference.
(EN)
