Mύκητες της υποκλάσης των Ασκομυκητων, έχουν την ικανότητα να προκαλούν ασθένειες σε διάφορα είδη φυτών. Η εφευρεση νεων εργαλείων μοριακής γενετικής ανάλυσης αποτελει αναγκη για την διερεύνηση των μηχανισμών πρόκλησης των ασθενειών από τους εν λόγω μύκητες και την καταπολεμηση τους.
Η γονιδιακή σίγηση, ως ενα σύγχρονο εργαλείο γενετικής ανάλυσης που επιτρέπει τη στοχευμένη καταστολή της έκφρασης γονιδίων σε μετα-μεταγραφικό επίπεδο, έχει δώσει νεες προοπτικες στη γενετική ανάλυση των ευκαρυωτων γενικά και ηδη χρησιμοποιείται ευρέως για τη διαλεύκανση της αλληλεπίδρασης φυτοπαθογονων μυκητων με φυτα-μοντελα.
Η παρουσα διατριβη αφορά στην επαγωγη της σίγησης στο υτοπαθογόνο ασκομύκητα Colletotrichum higginsianum. Για το σκοπό αυτό, επελέχθη το γονίδιο sgfp που κωδικεύει την πράσινη φθορίζουσα πρωτεϊνη (GFP) σαν γονιδιο στόχευσης/αναφοράς. Η στρατηγική που ακολουθήθηκε συνίστατο στο σχεδιασμο και την κατασκευη καταλληλων σιγητικών κασσετών οι οποίες φέρουν τμήμα του γονιδίου sgfp υπο τον έλεγχο ευκαρυωτικού υποκινητή και την ενσωμάτωσή τους σε πλασμιδιακους φορεις ικανούς να εισαχθουν στο μυκητα και να επαγουν γονιδιακη σιγηση, και ακομα στην εισαγωγη μιας αντικωδικής κασέτας (antisensegfp, AS-gfp-cas), σε στέλεχος του μυκητα το οποιο ήδη εξεφραζε το γονιδιο sgfp, καθώς για την κατάδειξη της μετα-μεταγραφικης σιγησης του γονιδιου στο στέλεχος-δέκτη.
Η κατασκευη των πλασμιδιων με σιγητικές κασσέτες PminiGPDA-AS-gfp-nosT και
PminiGPDA-S/AS-gfp-nosT -hairpin) περιελαμβανε την κλωνοποιηση τμήματος του γονιδίου sgfp σε καταλληλους πλασμιδιακούς φορείς υπό ευκαρυωτικό υποκινητη (PminiGPDA) και τερματιστη (nosT) της μεταγραφής και τη μεταφορά τους σε δυαδικo φορέα αγροβακτηρίου (pBIG4) που έφεραν ως γονίδια επιλογής τα bar και nptΙI (για αντοχή στo ζιζανιοκτονο BASTA και στο αντιβιoτικό γενετισινη, αντίστοιχα) , υπο τον ελεγχο του υποκινητη που PminiGPDA.
Μια σιγητική κασσέτα (AS-gfp-cas) είσηχθη σε στέλεχος του μύκητα που ήδη εξέφραζε συστατικά τη φθορίζουσα πρωτεϊνη, με συνεπώαση σπορίων ενός σταθερού sGfp+ στελέχους του με καλλιέργεια Αγροβακτηριου (στέλεχος AGLI) στο οποίο ειχε προηγουμενως εισαχθεί το δυαδικό πλασμιδιο/φορέας (pBIG-AS-gfpcas).
Φαινοτυπικός έλεγχος των υφών του μετασχηματισμενου μυκητα μετά από διαδοχικές επανακαλλιέργειες θαλλών του μύκητα σε θρεπτικό μέσο επιλογής με αυξανόμενες συγκεντρώσεις BASTA έδειξε ότι σε ένα αριθμό θαλλών και σε αρχικά στάδια της επιλογής ένα ποσοστό των υφών του μήκητα ειχε μειωμένα ή μηδενικά επίπεδα φθορισμου στο υπεριωδες φως (UV), σε σχεση με το μητρικο στελεχος-
δέκτη. Έγιναν προσπάθειες αυξησης του βαθμού σίγησης με επανακαλιέργειες θαλλών σε αυξημένες συγκέντρωσεις του ΒΑSΤΑ και με απομόνωση μονοσπορων θαλλών από θετικούς ως προς τη σίγηση θαλλους, και επίσης προσδιοριστηκαν τα επιπέδα του gfp-mRNA σε επιλεγμενους θαλλους του μύκητα.
(EL)
Fungi form a large and diverse group of eukaryotic organisms, including about 100,000 known species. As a group, fungi have enormous impact on human affairs and in the functioning of ecosystems as primary decomposers. Certain groups of fungi (e.g.,
mycorrhizal fungi) have symbiotic association with plants or algae, from which they obtain carbohydrates and in turn, they provide mineral ions and water. Over 90% of land plants are considered to have a fungus associated on their roots and many would not survive
without their fungal partner. Fungi consider to be important agents for the production of fermented foods (e.g., wine, bread, cheese and soy sauce), and for the industrial manufacture of enzymes and antibiotics. Some fungi have parasitic life cycles and cause a wide variety of diseases in animals, humans, and plants.
Fungi are the most important group of plant pathogens, causing serious losses in crop yield and marketability worldwide. Several species, e.g., Neurospora crassa, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe and Aspergillus nidulans, have
provided sophisticated genetic systems for basic science, since their cellular structures, metabolic mechanisms and gene organization are similar to those of higher eukaryotes such as plants and animals. Their advantages as model organisms include the ease with
which fungi can be genetically and molecularly manipulated, because of their small haploid genome (compared to other higher eukaryotes) and their short life cycles.
Colletotrichum is a large genus of Ascomycete fungi, containing many species which cause anthracnose or blight diseases on a wide range of crop and ornamental plants.
Species from this genus have been used in studies concerning fungal differentiation and fungal–plant interactions. During the colonization of plant hosts, fungal pathogens exhibit two main modes of nutrition: biotrophy, where nutrients are obtained from living host cells,
and necrotrophy, where nutrients are obtained from dead host cells which have been killed by the fungus. Both of these nutritional strategies are exhibited by species from the genus Colletotrichum.
Research on fungi is at the cutting edge of many scientific fields including population and Molecular Genetics, Cell Biology, Developmental Biology, Photobiology, Evolution, and
gene silencing.
Quelling is a gene silencing phenomenon which is believed to belong to the broad category of RNA-mediated gene silencing mechanisms including post-transcriptional gene silencing (PTGS). Quelling was originally described in N. crassa as the reversible inactivation of gene expression by the transformation of the organism, with repeated
homologous sequences affecting both transgenes and endogenous genes (6)
RNA silencing and gene knock-out approaches have different advantages; thus, a combined approach of RNA silencing and gene knock-out technologies would greatly facilitate exploring gene function in fungi in the post-genomics era.
Concerning the mechanism of RNAi-related pathways, when a double-stranded RNA (dsRNA) trigger is introduced into the cell, it is processed by an RNaseIII family enzyme called the Dicer. This processing produces dsRNA fragments known as small interfering
RNAs (siRNAs) that are of 21 nucleotides in length. These siRNAs are then incorporated in into an effector complex called the ‘RNA-induced silencing complex’, or ‘RISC’ which is defined by two components: an Argonaute protein and the siRNA or miRNA sequence which guides the RISC complex to its target through base complementarity.
The purpose of this study was to construct plasmids, capable of inducing posttranscriptional gene silencing of the expression of the gfp gene on the fungus Col. higginsianum. The fungal strain that was used already expressed the (sense) gfp gene.
The purpose of the silencing cassettes AS-gfp and S/AS-gfp (hairpin), which were constructed on the backbone of the binary vector pBIG4, was to introduce antisense dsRNA into the fungal cell that would trigger post-transcriptional gene silencing (PTGS).
The sgfp gene was selected as the reporter of expression. Resistance genes have been used for the selection of the transformants. Strains that carry the plasmid, provide the resistance. The bar gene encodes an acetyl-transferase protein which catalyses the acetylation of the active metabolite of bialaphos and renders it inactive. Bialaphos is a
herbicide that inhibits glutamine synthase, resulting in glutamine deficiency. Geneticin (G418) blocks polypeptide synthesis by inhibiting the elongation step in both prokaryotic and eukaryotic cells. Resistance to G418 is conferred by the neo gene (nptII) from Tn5
encoding an amino-glycoside 3‘-phospho-transferase.
Several plasmid vectors have been constructed and one of them, pBIG4-AS-gfp-cas was used for the transformation of a stable C. higginsianum strain that expresses the sgfp gene, using the Agrobacterium tumefaciens mediated transformation protocol. The pBIG4- ASgfp-cas plasmid carries the silencing cassette of the sgfp gene in an antisense orientation relatively to the vector’s promoter, PminiGPDA. The antisense gfp cassette included two regulatory sequences, the PminiGPDA promoter (from A.nidulans) as well as
the nosT terminator (nopaline synthase from A.nidulans). The pBIG4-AS-gfp-cas, also carries the bar gene.
For the construction of this plasmid, pBIG4-AS-gfp-cas, the sgfp gene was amplified with PCR with Taq polymerase and a pair of specific primers (M13), using the pHPH plasmid as a template. Then, it was ligated to a pGEM-T-Easy vector (using T4 DNA ligase) which
carried suitable restriction sites (EcoRI). Finally, the sgfp gene was transfered along with the EcoRI sites (on both edges), on the pBluesctipt-SK-PminiGPDA-nosT vector, which already carried the PminiGPDA promoter and the nosT terminator, in an antisense
orientation relative to the promoter. This cassette, was sequentially transfered enzymatically to the binary vector pBIG4, to acquire the pBIG4-AS-gfp-cas vector. (Diagram I).
Also, different vectors have been constructed. The plasmid pBIG4-nptII-cas, carries the nptII gene (see the Diagram), while the pBIG4-S/AS-gfp (hairpin) plasmid, contains the sense sgfp gene followed by a spacer and the antisense gfp gene, as the silencing
cassette.
Each cloning step was tested with test digestions. Agarose gel electrophoresis revealed the DNA fragments derived from each enzymatic digestion. Moreover, plasmid clones were routinely sequenced using suitable primers to confirm the test digestions and ensure the correct plasmid/cassette structure.
(EN)
