Μελέτη του μεταβολισμού της φαινόλης από ένα νέο βακτήριο του γένους Pseudomonas

 
Το τεκμήριο παρέχεται από τον φορέα :

Αποθετήριο :
E-Locus Ιδρυματικό Καταθετήριο
δείτε την πρωτότυπη σελίδα τεκμηρίου
στον ιστότοπο του αποθετηρίου του φορέα για περισσότερες πληροφορίες και για να δείτε όλα τα ψηφιακά αρχεία του τεκμηρίου*
κοινοποιήστε το τεκμήριο




2004 (EL)

Μελέτη του μεταβολισμού της φαινόλης από ένα νέο βακτήριο του γένους Pseudomonas

Τσιρογιάννη, Ειρήνη (EL)
Tsirogianni, Eirini (EN)

Η διαδικασία αποικοδόμησης μονοαρωματικών ενώσεων και κυρίως ο μηχανισμός αποικοδόμησης της φαινόλης από το νέο βακτήριο phDV1 του γένους Pseudomonas, υπήρξε αντικείμενο μελέτης της παρούσας εργασίας. Η πλήρης αποκωδικοποίηση του γονιδιώματος του βακτηρίου Pseudomonas aeruginosa καθώς και ο λειτουργικός χαρακτηρισμός πολλών πρωτεϊνών, διαφόρων βακτηριακών στελεχών του γένους Pseudomonas υπήρξαν χρήσιμα εργαλεία στη διαδικασία μελέτης του μηχανισμού αποικοδόμησης της φαινόλης. Για τον προσδιορισμό του μεταβολικού μονοπατιού που ακολουθεί το βακτήριο για το μεταβολισμό της φαινόλης απομονώθηκε και χαρακτηρίστηκε το ένζυμο «κλειδί» στην διάσπαση του αρωματικού δακτυλίου της κατεχόλης, η 2,3 διοξυγενάση της κατεχόλης. Η απομόνωση του ενζύμου πραγματοποιήθηκε με διαβάθμισης ζάχαρης και ανιοντική χρωματογραφία, ενώ ο χαρακτηρισμός του ενζύμου έγινε με φασματοφωτομετρία υπεριώδους-ορατού και φασματομετρία μάζας. Στη συνέχεια, προσδιορίστηκαν και τα υπόλοιπα ένζυμα που συμμετέχουν στο μεταβολισμό της φαινόλης. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκε αρχικά δύο διαστάσεων ηλεκτροφόρηση μία μέθοδος που επιτρέπει το διαχωρισμό μεγάλου αριθμού πρωτεϊνών. Πιο συγκεκριμένα οι υδατοδιαλυτές πρωτεΐνες κυττάρων που καλλιεργήθηκαν σε φαινόλη και γλυκόζη, αντίστοιχα, ηλεκτροφορήθηκαν αρχικά σε πηκτές πολυακρυλαμιδίου με διαβάθμιση pH (Ισοηλεκτρική εστίαση με αμφολύτες φορείς). Στη συνέχεια ακολούθησε αποδιατακτική ηλεκροφόρηση ώστε να ληφθεί το πρωτεϊνικό αποτύπωμα των δύο δειγμάτων και να γίνει σύγκριση μεταξύ τους. Η μέθοδος αυτή δεν είχε μεγάλη επαναληψιμότητα λόγω της πρώτης διάστασης της ισοηλεκτρικής εστίασης που χρησιμοποιήθηκαν πηκτές ακρυλαμιδίου που παρασκευάσαμε με αμφολύτες φορείς. Στη συνέχεια δοκιμάστηκε κλασματοποίηση των υδατοδιαλυτών πρωτεϊνών με χρήση υπερφυγοκέντρησης σε διαβάθμιση ζάχαρης ώστε να γίνει απλούστευση και εμπλουτισμός του δείγματος με πρωτεΐνες που συμμετέχουν στο μεταβολισμό της φαινόλης Στη συνέχεια οι πρωτεΐνες ηλεκτροφορήθηκαν σε πηκτή αποδιατακτικής ηλεκτροφόρησης ώστε να εντοπισθούν πρωτεϊνικές διαφοροποιήσεις μεταξύ των δειγμάτων των διαφορετικών καλλιεργειών. Με χρήση φασματομετρίας μάζας επιτεύχθει η ταυτοποίηση όλων των βασικών ενζύμων που συμμετέχουν στο μέτα μεταβολικό μονοπάτι αποικοδόμησης της φαινόλης. Στη συνέχεια έγινε προσπάθεια προσδιορισμού πιθανών αλληλεπιδράσεων μεταξύ των ενζύμων που συμμετέχουν στο μεταβολισμό της φαινόλης με χρήση μη αποδιατακτικής ηλεκτροφόρησης (Blue Native ηλεκτροφόρηση) σε συνδυασμό με δεύτερη διάσταση αποδιατακτικής ηλεκτροφόρησης και ταυτοποίηση των πρωτεϊνών με φασματομετρία μάζας. Κατά τη διαδικασία αυτή βρέθηκαν ταυτοποιήθηκαν πρωτεϊνικά σύμπλοκα που περιέχουν ένζυμα του μεταβολισμού της φαινόλης αλλά και άλλες υδατοδιαλυτες πρωτεΐνες του κυττάρου. (EL)
The subject of this study is the aerobic catabolism of aromatic compounds and specially the metabolic pathway of phenol degradation of the new soil bacterium Pseudomonas sp. Strain phDV1. The key enzyme catalyzing the second step in the phenol degradation meta-cleavage pathway, catechol-2,3-dioxygenase (C2,3O), was isolated using sucrose density centrifugation and anion exchange chromatography. The C2,3O was detected and identified by absorption spectroscopy and peptide mapping. Further, the Pseudomonas sp. strain phDV1 proteome was monitored under different growth substrate conditions, using glucose or phenol as sole carbon source. In the beginning, the cytosolic proteins were subjected to two-dimensional gel electrophoresis. The first dimension was isoelectric focusing (IEF) and the second dimension was SDS-PAGE electrophoresis. This method didn’t have high reproducibility because in the first dimension the pH gradient were formed by carried ampholites. To decrease the complexity of the sample was used ssucrose density centrifugation. In that way we succeeded to collect and concentrate the cell fraction exhibiting C2,3O activity and to reduce the complexity of the total protein mixture. 1-DE Tricine PAGE electrophoresis separation in combination with MALDI-TOF MS was attempted for the identification of the proteins involved in the metabolic pathway. From 19 proteins that are more abundant in phenol, 10 were identified as enzymes involved in the phenol degradation. Two-dimensional gel electrophoresis (Native-SDS PAGE) was used to study the protein interactions. The proteins were analysed by MALDI TOF MS. (EN)

text
Τύπος Εργασίας--Μεταπτυχιακές εργασίες ειδίκευσης


2004-07-26
2004-04-01


Σχολή/Τμήμα--Σχολή Θετικών και Τεχνολογικών Επιστημών--Τμήμα Χημείας--Μεταπτυχιακές εργασίες ειδίκευσης




*Η εύρυθμη και αδιάλειπτη λειτουργία των διαδικτυακών διευθύνσεων των συλλογών (ψηφιακό αρχείο, καρτέλα τεκμηρίου στο αποθετήριο) είναι αποκλειστική ευθύνη των αντίστοιχων Φορέων περιεχομένου.