Η νεο-αγγειογένεση είναι μια σύνθετη και πολυσταδιακή διεργασία που οδηγεί στο σχηματισμό νέων αγγείων αίματος από το προϋπάρχον αγγειακό δίκτυο των ιστών. Πρόσφατες πειραματικές και κλινικές μελέτες απέδειξαν ότι η νεο-αγγειογένεση είναι απαραίτητη στον καρκίνο για την εξέλιξη, τη διεισδυτικότητα και τη μετάσταση. Μάλιστα η ανάπτυξη του καρκινικού όγκου πέραν των 1-2mm στηρίζεται αποκλειστικά και μόνο στην νεο-αγγειογένεση, η οποία συνεισφέρει και στην μεταστατική διαδικασία. Ο μηχανισμός που ελέγχει το αγγειογενετικό δυναμικό σε έναν όγκο δεν έχει διευκρινιστεί μέχρι σήμερα. Πιστεύεται ότι είτε αυξάνεται υπέρμετρα η έκφραση αγγειογενετικών παραγόντων είτε αναστέλλεται η παραγωγή των αγγειοκατασταλτικών, διαταράσσοντας τη φυσιολογική ισορροπία. O συνδυασμός περιβαλλοντικών και γενετικών αλλαγών φαίνεται να επηρεάζει την έναρξη της διαδικασίας. Ο ρόλος του φαινομένου της αγγειογένεσης έχει περιγραφεί σε όλους σχεδόν τους καρκίνους του ανθρώπου, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του μαστού και σε μικρότερο βαθμό στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας. Υποστηρίζεται ότι αποτελεί ένα συνοδευτικό γεγονός στη διαδικασία της καρκινογένεσης και μπορεί να αποτελέσει ένδειξη και μέτρο του σταδίου της καρκινικής εξαλλαγής. Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η διερεύνηση του μηχανισμού που ελέγχει την επαγωγή της αγγειογενετικής δραστηριότητας στα κυριότερα νεοπλάσματα που προσβάλλουν τον γυναικείο πληθυσμό και να προσδιορίσουμε τυχόν ομοιότητες ή διαφορές στην αγγειογενετική διαδικασία που συνοδεύει την κακοήθη εξαλλαγή των επιθηλιακών κυττάρων σε αυτούς τους καρκίνους. Για το λόγο αυτό μελετήσαμε την έκφραση σε επίπεδο mRNA των αυξητικών παραγόντων VEGF, bFGF, TGF-β1, β2, β3 και των υποδοχέων του TGF-β RI, RII, RIII με τη μέθοδο της RT-PCR σε δείγματα ιστών με καρκίνο του μαστού καθώς και σε παρακείμενους φυσιολογικούς ιστούς από τις ίδιες ασθενείς. Επίσης εξετάσθηκαν τα επίπεδα πρωτεϊνικής έκφρασης των VEGF και TGF-β1 (western blot analysis) και συσχετίστηκαν με την έκφραση σε επίπεδο mRNA. Στο δεύτερο μέρος της παρούσας διατριβής η μελέτη έκφρασης των παραπάνω αυξητικών παραγόντων επαναλήφθηκε σε δείγματα ιστών από ενδοεπιθηλιακές νεοπλασίες, καρκίνο του τραχήλου της μήτρας και σε φυσιολογικό τράχηλο. Στόχος της μελέτης ήταν: α) να ταυτοποιηθεί το προφίλ έκφρασης των κυριότερων αγγειογενετικών παραγόντων που έχει δειχθεί ότι εμπλέκονται στην αγγειογένεση, β) να διερευνηθεί η συσχέτισή του με τα κλινικά χαρακτηριστικά των δειγμάτων και κυρίως με την έκταση και βαρύτητα της κακοήθους βλάβης και γ) να ελεγχθεί η πιθανότητα χρήσης του μοριακού προτύπου έκφρασης των αυξητικών παραγόντων ως μοριακού δείκτη της αγγειογένεσης και του κινδύνου καρκινικής εκτροπής των επιθηλιακών κυττάρων στα γυναικεία νεοπλάσματα. Τα αποτελέσματα της μελέτης στον καρκίνο του μαστού έδειξαν στατιστικά σημαντική αύξηση των επιπέδων mRNA του TGF-β3 και μείωση αυτών του bFGF στα καρκινικά δείγματα σε σύγκριση με τους φυσιολογικούς ιστούς (P=0.031, 0.043 αντίστοιχα). Αύξηση παρατηρήθηκε και στο mRNA του VEGF αλλά δεν ήταν στατιστικά σημαντική. Τα επίπεδα πρωτεΐνης του VEGF βρέθηκαν αυξημένα σε καρκινικούς ιστούς ασθενών μετά την εμμηνόπαυση (P=0.01). Τα mRNA επίπεδα των TGF-β1, β3 βρέθηκαν να διαφέρουν ανάλογα με τον ιστολογικό τύπο των καρκινωμάτων (P=0.020, 0.043 αντίστοιχα), ενώ διαπιστώθηκε ισχυρή ορμονική επίδραση των υποδοχέων οιστρογόνων και προγεστερόνης στην mRNA έκφραση των περισσοτέρων υποκαταστατών και υποδοχέων του TGF-β. Τα επίπεδα πρωτεΐνης του TGF-β1 βρέθηκαν να συσχετίζονται αρνητικά με αυτά του mRNA (P=0.016) από την ανάλυση ζευγών δειγμάτων. Η μελέτη του προτύπου έκφρασης (συν-έκφραση των παραγόντων ανά δυο) αποκάλυψε απορρύθμιση του προφίλ mRNA έκφρασης των αυξητικών παραγόντων που μελετήσαμε στον καρκίνο συγκριτικά με τους φυσιολογικούς ιστούς. Τα αποτελέσματα της μελέτης στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας έδειξαν στατιστικά σημαντική αύξηση των επιπέδων mRNA των VEGF, TGF-β1, TGF-β RI και μείωση αυτών του bFGF αυξανομένης της επιθηλιακής βλάβης (normal, CIN, Cancer) (P=0.015, 0.001, 0.008, και 0.029 αντίστοιχα). Οι υψηλού βαθμού ενδοεπιθηλιακές βλάβες (High-grade SIL) επέδειξαν σημαντικά υψηλότερα επίπεδα mRNA του VEGF συγκριτικά με τις χαμηλού βαθμού αλλοιώσεις (Low-grade SIL) (P=0.039), και αυξανομένης της βαρύτητας της ενδοεπιθηλιακής αλλοίωσης (CIN I, II, III) (P<0.0001). Οι υποδοχείς TGF-β RΙ και TGF-β RΙΙΙ επέδειξαν στατιστικά σημαντική συσχέτιση συν- έκφρασης μεταξύ τους σε επίπεδο mRNA καθώς και με τους υποκαταστάτες TGF-β2, β1 (P<0.0001, 0.005, 0.002 αντίστοιχα) στα φυσιολογικά δείγματα τραχήλου, επιβεβαιώνοντας το γνωστό μηχανισμό μεταγωγής σήματος του TGF-β μέσω σχηματισμού του ετερο-τετραμερούς συμπλόκου-σηματοδότη. Εντούτοις, διαπιστώθηκε απορρύθμιση του προφίλ συν-έκφρασης του συνόλου των αυξητικών παραγόντων που μελετήθηκε, τόσο στις ενδοεπιθηλιακές βλάβες (CIN), όσο και στον καρκίνο του τραχήλου σε σύγκριση με την ομάδα των φυσιολογικών ιστών. Περισσότερες και πιο ισχυρές συσχετίσεις παρατηρήθηκαν στην ομάδα των φυσιολογικών δειγμάτων, λιγότερες στις CIN βλάβες και ακόμα λιγότερες στον καρκίνο. Από τη σύγκριση των αποτελεσμάτων μας στον καρκίνο του μαστού και του τραχήλου της μήτρας διαπιστώσαμε ότι διαφορετικοί αυξητικοί παράγοντες φαίνεται να κυριαρχούν στην αγγειογενετική δραστηριότητα που συνοδεύει την κακοήθη εξαλλαγή σε κάθε τύπο καρκίνου. Η απορρύθμιση της έκφρασης σε επίπεδο mRNA των VEGF, bFGF, TGF-β1, και του υποδοχέα TGF-β RI εμπλέκεται στη διαδικασία της καρκινικής εκτροπής στον τράχηλο της μήτρας, αλλά τα επίπεδα mRNA του bFGF και του TGF-β3 διαφέρουν σημαντικά στα καρκινικά και φυσιολογικά δείγματα του μαστού. Η σύγκριση των επιπέδων έκφρασης των αυξητικών παραγόντων που μελετήθηκαν, με τα κλινικοπαθολογικά χαρακτηριστικά των όγκων απέδωσε επίσης διαφορετικά αποτελέσματα, ενισχύοντας την άποψη ότι ο μηχανισμός που ελέγχει την αγγειογένεση ρυθμίζεται και από περιβαλλοντικούς παράγοντες (context dependent). Η απορρύθμιση όμως του προφίλ συν-έκφρασης του συνόλου των αυξητικών παραγόντων που μελετήσαμε στον καρκίνο (και στις ενδοεπιθηλιακές βλάβες) σε σύγκριση με τους υγιείς ιστούς, είναι κοινό στοιχείο και στους δύο τύπους καρκίνων και προσδίδει επιπλέον αποδείξεις ότι η ανάπτυξη καρκίνου συνοδεύεται από διατάραξη της φυσιολογικής ισορροπίας επαγωγέων και καταστολέων της αγγειογένεσης. Τα ευρήματα της παρούσας διατριβής παρέχουν ενδείξεις για την πιθανή χρήση του προφίλ έκφρασης των αυξητικών παραγόντων ως μοριακού δείκτη της αγγειογένεσης και του κινδύνου καρκινικής εκτροπής των επιθηλιακών κυττάρων στα γυναικεία νεοπλάσματα.
(EL)
Angiogenesis is a complex and multistep process leading to the formation of new blood vessels from the pre-existing vascular network. Recent experimental and clinical data have demonstrated that angiogenesis is essential for tumor development and metastasis. Tumor growth more than 1-2mm is solely dependent on angiogenesis. The mechanism that controls the angiogenic potential of a tumor remains unclear. It is believed that either up regulation of angiogenic growth factors, or down regulation of naturally occurring inhibitors, leads to the disruption of their net balance and initiates the angiogenic switch. Environmental and genetic changes seem to affect the angiogenic process as well. The role of angiogenesis has been described in all human cancers including breast and cervical cancer. It is believed to play an accompanying role in carcinogenesis and it is suggested to comprise a marker of malignant transformation. The purpose of the present study is to investigate the mechanism that controls the induction of the angiogenic process in the most frequent female cancers, as well as to determine similarities or differences in the procedure that accompanies the malignant conversion of normal breast and cervical epithelial cells. Therefore, we evaluated the mRNA expression of VEGF, bFGF, TGF-β1, β2, β3 and the receptors TGF-β RI, RII, RIII by RT-PCR in breast cancer tissue samples and adjacent normal specimens. We also evaluated the protein levels of VEGF and TGF-β1 (western blot analysis), and we examined the correlation with their mRNA expression levels. Furthermore, the mRNA expression profile of the same growth factors was investigated in tissue samples with cervical intraepithelial neoplasia (CIN) and cervical cancer and compared to that of normal cervical tissues. Our goals were: a) to determine the mRNA expression profile of the main growth factors implicated in angiogenesis, b) to examine the possible correlation of the mRNA expression profile with the clinical stage of the disease, or other clinicopathological features of the specimens, and c) to examine the possibility of using the mRNA expression profile of growth factors as a molecular marker of angiogenesis and malignant transformation of epithelial cells. Our results show significant differences in TGF-β1 and TGF-β3 mRNA levels in breast cancer specimens of differing histology (ductal, lobular, other) (P=0.020 and P=0.043). VEGF mRNA was elevated in tumor specimens compared to controls but the increase was not statistically significant. VEGF protein in tumors was associated with patients menopausal status. A strong hormonal influence of ER and PR on TGF-β mRNA expression was established. FGF2 transcript levels were substantially decreased in cancer compared to adjacent normal specimens (P=0.031). Western blot analysis revealed differences between VEGF and TGFβ1 mRNA and protein levels. A substantial negative correlation of TGF-β1 protein and TGF-β1 mRNA levels (p=0.016) was demonstrated by breast tissue-pair analysis. A disruption of mRNA co-expression patterns was observed in malignant breast tissues compared to controls. VEGF, TGFB1, TGFBR1, and FGF2 transcript levels were significantly different in the normal, CIN and cancer specimen groups (P=0.015, 0.001, 0.008, and 0.029 respectively). Higher TGFBR1 mRNA levels were observed in parallel with increased severity of the lesion, whereas FGF2 exhibited lower transcript levels. A highly significant increase of VEGF mRNA expression was found upon cervical neoplastic transformation (P<0.0001). High-grade squamous intraepithelial lesions exhibited higher VEGF mRNA levels than low-grade lesions (P=0.039). TGFBR1 and TGFBR3 receptors demonstrated significant co-expressions with TGFB2 (P<0.0001), and TGFB1 (P=0.005 and P=0.002 respectively) in normal cervical specimens. However, a disruption of co-expression patterns was observed in the groups of CIN and cancer cases, compared to normal tissues. Our results in breast and cervical cancer indicate that different growth factors prevail in the angiogenic process accompanying the malignant transformation of epithelial cells in each type of cancer. The disruption of VEGF, bFGF, TGF-β1, and TGF-β RI mRNA expression is implicated in cervical carcinogenesis, whereas only bFGF and TGF- β3 mRNA expression was significantly different in the groups of cancer and adjacent normal breast tissues. Correlation of mRNA expression levels of the growth factors studied with clinicopathological features of the specimens, revealed differences in breast and cervical cancer suggesting that angiogenesis is context dependent. A common feature of both types of cancer however, is the disruption of mRNA co-expression patterns of all growth factors included in our evaluation, in cancer (and CIN lesions) compared to normal specimens. The latter provides additional evidence that tumor development is accompanied by the disruption of the net balance of angiogenic growth factors and naturally occurring inhibitors. Our findings suggest that the mRNA expression profile of growth factors could possibly be used as a molecular marker of angiogenesis and a marker of malignant conversion of normal epithelial cells in female cancers.
(EN)
