Με σκοπό να διερευνήσουμε τους μηχανισμούς επαγωγής
απόπτωσης από την TRAIL και την επιλεκτικότητα την οποία δείχνει
απέναντι στα καρκινικά κύτταρα, χρησιμοποιήσαμε κυτταρικές σειρές,
προερχόμενες από το παχύ έντερο ανθρώπου, οι οποίες αντιπροσωπεύουν
τα διάφορα στάδια της καρκινογένεσης, από το πρώιμο αδένωμα στο
καρκίνωμα. Παρατηρήθηκε μια ανθεκτικότητα των πρώιμων αδενωμάτων
απέναντι στην TRAIL σε αντίθεση με τα κύτταρα που προέρχονται από
καρκίνους προχωρημένου σταδίου, ενώ σημαντικό ρόλο φαίνεται να παίζει,
εκτός από το στάδιο καρκινογένεσης και η ύπαρξη ορισμένων ογκογονιδίων
στον καθορισμό της ευαισθησίας των κυττάρων απέναντι στην TRAIL.
Συγκεκριμένα, οι διάφορες ισομορφές του ογκογονιδίου RAS παίζουν
ιδιαίτερο ρόλο τόσο όσο αφορά την ανταπόκριση του κύτταρου στην
επαγωγή με TRAIL, όσο και στη ρύθμιση των μορίων που εμπλέκονται
άμεσα στο μονοπάτι σηματοδότησης του TRAIL. Τα ογκογονίδια RAS
παίζουν σημαντικό ρόλο στην καρκινική εξαλλαγή ενεργοποιώντας μια σειρά
από μονοπάτια σηματοδότησης που οδηγούν στην ανεξέλεγκτη κυτταρική
διαίρεση και στην προστασία από τα αποπτωτικά σήματα. Εντούτοις, η
TRAIL (Tumor Necrosis Factor Related Apoptosis Inducing Ligand) έχει τη
δυνατότητα να προκαλεί απόπτωση κυρίως στα καρκινικά κύτταρα,
ενεργοποιώντας τους υποδοχείς DR4 και DR5 (Death Receptors). Σε αυτή
τη μελέτη δείξαμε ότι σε αδενοκαρκινώματα του παχέος εντέρου ανθρώπου
η έκφραση των υποδοχέων της TRAIL ρυθμίζεται από την ενεργότητα της
κινάσης MEK (MAPK/ERK Kinase).
Η ευαισθησία στην TRAIL των κυτταρικών σειρών που
χρησιμοποιήσαμε φάνηκε να συσχετίζεται με το βαθμό κακοήθους
εξαλλαγής. Συγκεκριμένα, οι κυτταρικές σειρές AAC1 και RGC2, που
προέρχονται απο πρώιμα αδενώματα και η κυτταρική σειρά Caco2, που
προέρχεται απο μέσο αδένωμα παρουσίασαν μεγάλη ανθεκτικότητα στην
TRAIL. Αντίθετα, οι κυτταρικές σειρές DLD-1 και HT-29, που προέρχονται
απο αδενοκαρκινώματα προχωρημένου στάδιου ήταν ευαίσθητες στην
TRAIL. Επιλέχθηκε η κυτταρική σειρά Caco2 η οποία είναι ανθεκτική στην
TRAIL και οι δύο κυτταρικές σειρές που προέρχονται από προχωρημένα αδενοκαρκινώματα για να εξεταστεί η έκφραση σημαντικών μορίων για την
αποπτωτική σηματοδότηση από την TRAIL. Φάνηκε μια αντιστοιχία της
έκφρασης των υποδοχέων DR4 και DR5 με την ευαισθησία των κυττάρων
στην TRAIL, ενώ τα επίπεδα έκφρασης των FADD, κασπάση 8, κασπάση 3
και FLIP δεν παρουσίασαν παρόμοια αντιστοιχία. Επιπλέον, παρατηρήθηκε
παρατεταμένη ενεργοποίηση των κινασών MEK, ERK, JNK1/2 και p38 μετά
από επαγωγή με TRAIL, σε αντίθεση με την αντίστοιχη κινητική
ενεργοποίησης των ίδιων κινασών μετά από επαγωγή με ορό. Αντίστοιχη
κινητική με αυτή των ΜΕΚ και ERK παρουσίασε η έκφραση του γονιδίου c-
FOS μετά από επαγωγή με TRAIL ή ορό. Τα κύτταρα Caco2, DLD-1 και HT-
29 επωάστηκαν με χημικούς αναστολείς των κινασών ΜΕΚ για 16 h και
ελέγχθηκε η έκφραση των DR4 και DR5. Τα επίπεδα των DR4 και DR5
μειώθηκαν και στις τρεις κυτταρικές σειρές ως συνέπεια της αναστολής της
ΜΕΚ, ενώ η αναστολή των ΜΕΚ δεν επιρρέασε τα επίπεδα των FADD, FLIP,
κασπάση 8, κασπάση 3 και τον υποδοχέα FAS που ανήκει στην ίδια
οικογένεια με τους DR4 και DR5. Επιπλέον, ελέγχθηκε με ανάλυση FACS η
έκφραση των υποδοχέων DR4, DR5 και FAS in vivo σε ζωντανά κύτταρα
που προεπωάστηκαν με τον αναστολέα της ΜΕΚ και στους αντίστοιχους
μάρτυρες και τα αποτελέσματα ήταν αντίστοιχα με αυτά των in vitro
πειραμάτων. Οι παραπάνω παρατηρήσεις αποτελούν ισχυρές ενδείξεις για
το συσχετισμό της ενεργοποίησης της οδού MEK/ERK/FOS με με την
έκφραση των υποδοχέων DR4 και DR5 και με την ευαισθησία των κυττάρων
στην TRAIL, καθώς κύτταρα HT-29 που προεπωάστηκαν με τον αναστολέα
των ΜΕΚ παρουσίσαν μειωμένη ευαισθησία στην TRAIL.
Για τον προσδιορισμό των διακριτών επιδράσεων των ογκογονιδίων
RAS στον καρκίνο του παχέος εντέρου, διαμολύνθηκαν κύτταρα που
προέρχονται από μέσο αδένωμα του παχέος εντέρου (Caco2) με τα
ογκογονίδια Ki- και Ha-RAS. Μετά από εξέταση πολλών διαφορετικών
κλώνων επιλέχθηκαν για λεπτομερέστερη ανάλυση κλώνοι οι οποίοι δεν
υπερεκφράζουν την RAS σε πρωτεϊνικό επίπεδο πάνω από 3 φορές σε
σχέση με την ενδογενή RAS των μητρικών κυττάρων. Επιπλέον, ελέγχθηκε
αν οι κλώνοι που υπερεκφράζουν τις ογκογόνες RAS παρουσιάζουν
αυξημένη σηματοδότηση προς μονοπάτια κυτταρικής σηματοδότησης που
είναι γνωστό οτι ενεργοποιούνται από τις RAS. Τόσο οι κλώνοι Ki-RAS, όσο
και οι Ha-RAS, έδειξαν να ενεργοποιούν τα μονοπάτια σηματοδότησης RAF/MEK/ERK και PI3K/AKT με τους Ha-RAS να προκαλούν ισχυρότερη
ενεργοποίηση.
Σχεδιάστηκαν πειράματα για τον καθορισμό του βαθμού της in vitro
και in vivo κακοήθους εξαλλαγής. Τα πειράματα σε μαλακό άγαρ δείχνουν
την αποτελεσματικότητα των καρκινικών κυττάρων να αναπτύσσονται
δημιουργώντας αποικίες χωρίς να προσκολλώνται σε επιφάνεια. Οι δυο
ισομορφές της RAS αύξησαν σημαντικά την ιδιότητα των Caco2 να
σχηματίζουν αποικίες σε μαλακό άγαρ, ενώ η Ha-RAS παρουσίασε τη
μεγαλύτερη ικανότητα. Για τον προσδιορισμό του βαθμού κακοήθους
εξαλλαγής των κλώνων in vivo έγινε υποδόριος εμβολιασμός με περίπου 106
κύτταρα από τον κάθε κλώνο σε ποντίκια SCID. Τόσο η Κi-RASV12 όσο και
η Ha-RASV12 αύξησαν την ικανότητα των Caco2 να σχηματίζουν όγκους σε
ποντίκια SCID με την Ha-RAS να προκαλεί τον σχηματισμό περισσότερων
και μεγαλύτερων όγκων. Για την περαιτέρω κατανόηση των μηχανισμών
εξαλλαγής των κυττάρων από τα ογκογονίδια RAS αξιολογήθηκαν
αποτελέσματα από ανάλυση γονιδιακών μικροσυστοιχιών. Μετά από
ανάλυση του γονιδιακού προφίλ των CACO-RAS κλώνων και τα δυο
ογκογονίδια βρέθηκαν να επάγουν την έκφραση γονιδίων που εμπλέκονται
στην αγγειογένεση και στην προώθηση του καρκίνου, όπως τα γονίδια που
κωδικοποιούν τους υποδοχείς VEGF και TGFβ. Σημειώνεται ότι μεταστατικοί
δείκτες, όπως η Vimentin, που είναι και δείκτης της μετάβασης από
επιθηλιακό σε μεσεγχυματικό φαινότυπο, βρέθηκαν να υπερεκφράζονται
μόνο στους κλώνους Ha-RASV12. Ο in vitro και in vivo χαρακτηρισμός
εξαλλαγμένων κυττάρων από τα ογκογονίδια RAS, καθώς και η ανάλυση
μικροσυστοιχειών γονιδίων έδειξε ότι στο κυτταρικό μοντέλο που
χρησιμοποιήθηκε το ογκογονίδιο Ha-RAS έχει αυξημένες εξαλλακτικές
ιδιότητες.
Τα ογκογονίδια RAS αύξησαν το βαθμό κακοήθους εξαλλαγής των
κυττάρων Caco2 και ελέγχθηκε αν αυτό συνοδεύεται από αυξημένη
ευαισθησία των κλώνων CACO2-RAS στην TRAIL. Μετρήθηκε η
βιωσημότητα των κλώνων CACO2-RAS μετά από επαγώγη με TRAIL και
φάνηκε ότι και τα δύο ογκογονίδια αύξησαν την ανταποκρισιμότητα των
κυττάρων Caco2 στην TRAIL. Τα Caco2 που εξαλλάχθηκαν με την Ki-
RASV12 ήταν λιγότερο ευαίσθητα στην TRAIL από ότι αυτά με τη Ha-
RASV12 σε όλους τους κλώνους που ελέγχθηκαν. Ο έλεγχος της έκφρασης σημαντικών παραγόντων για την απόπτωση από την TRAIL έδειξε ότι οι
πρωτεΐνες που παρουσίασαν τις μεγαλύτερες διαφοροποιήσεις στους
κλώνους που υπερεκφράζουν τις RAS, σε σχέση με τα κύτταρα μάρτυρα,
ήταν οι υποδοχείς DR4 και DR5. Παρόλο που οι κλώνοι Ha-RAS
παρουσίασαν μεγαλύτερη ευαισθησία στην TRAIL, τα επίπεδα έκφρασης
των DR4 και DR5 ήταν παρόμοια μεταξύ των κλώνων Ki-RAS και Ha-RAS.
Για να ελεγχθεί κατά πόσο το μονοπάτι σηματοδότησης MEK/ERK παίζει
ρόλο στην υπερέκφραση των υποδοχέων από τα ογκογονίδια RAS
χρησιμοποιήθηκαν χημικοί αναστολείς της ΜΕΚ και ελέγθηκε η επίδρασή
τους στα επίπεδα των DR4 και DR5. H χημική αναστολή της ΜΕΚ
προκάλεσε μείωση των επιπέδων των φωσφορυλιωμένων ERK1/2 και των
επιπέδων έκφρασης των DR4 και DR5 τόσο στους CACO-Κ15, όσο και
στους CACO-Η2. Τέλος, ελέγχθηκε κατά πόσο η μείωση των DR4 και DR5
από την χημική αναστολή των ΜΕΚ μπορέι να έχει επίδραση στη δράση της
TRAIL απέναντι στους κλώνους CACO2-RAS και βρέθηκε ότι προεπώση
των Ha-RASV12 κλώνων για 16 h με χημικό αναστολέα των ΜΕΚ μέιωσε σημαντικά την ευαισθησία τους στην TRAIL.
In order to study the mechanism by which TRAIL (Tumor Necrosis
Factor Related Apoptosis Inducing Ligand) induces apoptosis almost
exclusively to cancer cells we used human colon cancer cell lines that
represent different stages of carcinogenesis, from early adenoma to
carcinoma. It was observed that early adenoma cells were resistant to
TRAIL-induced apoptosis. On the contrary, cells that were derived from
carcinomas were sensitive; while a correlation of the sensitivity of the cells to
TRAIL-induced apoptosis to the presence of certain activated oncogenes
was observed. In particular, the various isoforms of RAS oncogenes appear
to play an important role in the responsiveness of the cancer cells to TRAIL
as well as in regulating specific components which are essential for TRAIL
signaling. RAS oncogenes play an important role in oncogenic
transformation by activating various signaling pathways that favor tumor
growth also by controlling cell division and resistance to apoptotic stimuli.
TRAIL, however, has the unique ability to cause apoptosis preferentially to
cancer cells by activating DR4 and DR5 receptors. In this study we show
that in human colorectal adenocarcinomas cells the expression of DR4 and
DR5 is partially regulated by the activity of MEK (MAPK/ERK Kinase).
The sensitivity of the cell lines to TRAIL seemed to be correlated with
the level of oncogenic transformation of the cells. In particular, the AAC1 and
RGC2 cell lines that were derived from early adenomas and the Caco2 cell
line that was derived from an intermediate adenoma were very resistant to
TRAIL induced apoptosis. On the contrtary, the DLD-1 and HT-29 cell lines,
which came from advanced stage carcinomas were sensitive to TRAIL. The
Caco2 cell line, which is resistant to TRAIL and the cell lines that derived
from advanced stage adenocarcinomas were chosen for expression analysis
of important molecules in TRAIL-induced apoptosis. There was a correlation
of DR4 and DR5 expression with the sensitivity of the cell lines to TRAIL,
while the expression levels of FADD, Caspase 3, Caspase 8 and FLIP did
not seem to correlate with TRAIL sensitivity in these cell lines. In addition, it
was observed a prolonged activation of MEK, ERK1/2, JNK1/2 and p38 after
induction with TRAIL, which did not follow the kinetics of serum-induced
activation of ERK1/2. The activation of MEK and ERK1/2 was correlated to
the kinetics of c-FOS proto-oncogene expression induced by TRAIL or
serum. The expression levels of DR4 and DR5 were analysed after incubation for 16 h of the Caco2, DLD-1 and HT-29 cell lines with MEK
inhibitors. There was a decrease of DR4 and DR5 expression levels in
response to MEK inhibition, while the expression levels of FADD, Caspase
3, Caspase 8, FLIP and FAS receptor were not affected. Moreover, FACS
analysis of living cells showed that MEK inhibition reduces the levels of DR4
and DR5 but not of other receptors of the same family, in vivo. It appears
that the activation of the MEK/ERK/FOS axis plays a role in the positive
feedback loop of TRAIL its receptors DR4 and DR5.
To determine the distinct effects of different RAS oncogenes in cancer
cells colon intermediate adenoma cells (Caco2) were chosen for transfection
with the Ki- and Ha-RAS oncogenes. Clones that did not express more than
3 times the endogenous levels of RAS proteins were selected for further
analysis. In addition it was examined whether the CACO2-RAS clones are
able to activate the RAF/MEK/ERK and PI3K/AKT pathways, which are
known effectors of RAS proteins. Both RAS isoforms activated these two
pathways with the Ha-RASV12 clones presenting better potential in
activating both RAF/MEK/ERK and PI3K/AKT pathways.
In order to characterize the in vitro and in vivo oncogenic potential the
ability of the CACO2-RAS clones to grow in soft agar and to grow tumors in
nude mice was examined. The in vitro and in vivo characterization of the
Caco2 RASV12-transformed cells showed that the Ha-RAS oncogene has a
higher in vitro and in vivo transforming ability relative to the Ki-RAS
oncogene in these cells. Results from cDNA microarray analysis were
evaluated in order to further understand the mechanisms by which the RAS
oncogenes cause oncogenic transformation. Gene expression profile
analysis of the CACO2-RAS clones showed that both oncogenes induced
expression of genes involved in angiogenesis and tumor promotion such as
VEGF and TGFβ. Notably, metastatic markers, such as Vimentin, which is
also an epithelial to mesenchymal transition marker, were overexpressed
only in the Caco2 cells transformed with the Ha-RAS oncogene. The RAS
oncogenes increased the oncogenic potential of the Caco2 cells and it was
examined if the increased oncogenic potential correlated with increased
sensitivity to TRAIL. Moreover, the examination of the expression levels of
molecules important for TRAIL singnaling showed that Ki-RAS as well as
Ha-RAS oncogenes can induce DR4 and DR5 expression with similar efficiency. However, in spite of similar induction of DR4 and DR5 by the two
RAS oncogenes, the Ki-RAS-transformed cells were less susceptible to
TRAIL induced apoptosis. Finally, in order to see whether the increased
MEK/ERK activation observed in the CACO-RAS clones played a role in
increasing DR4 and DR5 levels the CACO-RAS clones were incubated for
16h in the presence of MEK inhibitors. MEK inhibition resulted in decreased
DR4 and DR5 expression levels, as well as decreased sensitivity of the
clones to TRAIL induced apoptosis.
