Οι επισωματικοί φορείς αποτελούν την εναλλακτική επιλογή για την μεταφορά
γονιδίων σε εφαρμογές γονιδιακής θεραπείας. Διπλασιάζονται αυτόνομα χωρίς να
ενσωματώνονται στα χρωμοσώματα του κυττάρου και έτσι στερούνται της σοβαρής
παρενέργειας του φαινομένου της μεταλλαξιγένεσης μέσω ενσωμάτωσης. Το
ενδιαφέρον ως προς την ανάπτυξη επισωματικών φορέων για την γονιδιακή μεταφορά
αυξήθηκε κατακόρυφα τα τελευταία χρόνια μετά την ανάπτυξη του φορέα pEPI-1, ο
οποίος περιείχε το στοιχείο S/MAR του γονιδίου της ανθρώπινης βήτα- ιντερφερόνης. Ο
φορέας αυτός είχε την ιδιότητα να διατηρείται επισωματικά χωρίς την ανάγκη
μεταγραφής κάποιου ιϊκού γονιδίου. Τα στοιχεία S/MAR αποτελούν ετερογενείς
περιοχές DNA οι οποίες συνδέονται στην θεμέλια ουσία του πυρήνα, συμμετέχοντας
στην οργάνωση του ευκαρυωτικού γονιδιώματος, στην αντιγραφή του DNA και στην
ρύθμιση της μεταγραφής. Αποφασίσαμε στην μελετήσουμε την δράση του S/MAR
στοιχείου σε ένα διαφορετικό περιβάλλον DNA. Ξεκινώντας από τον φορέα pCEP4 που
βασίζεται στα στοιχεία OriP και EBNA-1 του ιού η EBV κατασκευάσαμε τα εξής
πλασμίδια: 1) pEBS/eGFP με το S/MAR να είναι κλωνοποιημένο μετά το γονίδιο της
eGFP όπως στο pEPI-1. 2) pESdER / eGFP προερχόμενο από το pEBS/eGFP με
διαγραφή του γονιδίου EBNA-1 και.3) pCEP4 / eGFP (πλασμίδιο μάρτυρας). Σε
αντίθεση με τις προσδοκίες μας μόνο το πλασμιδίου pCEP4 / eGFP ήταν ικανό να
εγκαταστήσει σταθερές κυτταρικές σειρές Jurkat. Ο υπολογισμός της
αποσταθεροποίησης υπό τάση των παραπάνω πλασμιδίων απέδειξε μια υψηλή ουδό για
την αποσταθεροποίηση της περιοχής του OriP, σε αντίθεση με το μητρικό φορέα pCEP4,
γεγονός που οφείλεται στον ενεργειακό ανταγωνισμό μεταξύ του OriP και της υψηλά
αποσταθεροποιημένης περιοχής του S/MAR. Η αντικατάσταση του OriP στο πλασμίδιο
pESdER / eGFP από την περιοχή έναρξης της αντιγραφής το γονίδιο της β-σφαιρίνης
(IR) (pESdER-IR/eGFP) έχει ως αποτέλεσμα την αποκατάσταση της επισωματική της
κατάστασης, προσδίδοντας επιπλέον και υψηλή μιτωτική σταθερότητα χωρίς την ανάγκη
ύπαρξης πίεσης επιλογής σε καλλιέργειες για χρονικό διάστημα τριών μηνών. Συμπεράνουμε ότι το δυναμικό πολλαπλασιασμού ενός επισωματικού συστήματος που
περιέχει ένα στοιχείο S/MAR εξαρτάται από την ύπαρξη μιας δεύτερης υψηλά
αποσταθεροποιημένης έννοιες περιοχής ικανής να ξεπεράσει την σταθεροποιητική δράση
της αλληλουχίας S/MAR. Το γεγονός αυτό προσδίδει μια νέα διάσταση στη σχεδίαση
αυτόνομων επισωματικών φορέων, που περιέχει τον υπολογισμό της αποσταθεροποίησης
της διπλής έλικας DNA υπό τάση. Η ευρεία χρήση των ρετρο-ιϊκών φορέων ως συστήματα γονιδιακής μεταφοράς
σε κλινικές δοκιμές γονιδιακής θεραπείας έφερε στην επιφάνεια την ανάγκη για μια
ακριβή εκτίμηση της ασφάλειας των δοκιμών αυτών όσον αφορά το φαινόμενο της
μεταλλαξιγένεσης μέσω ενσωμάτωσης. Στην εργασία αυτή αναφέρεται μια νέα μέθοδος
για την ανίχνευση των θέσεων ενσωμάτωσης των ρετρο-ιϊκών φορέων που έχει κλινικό
προσανατολισμό και ονομάζεται DSCP-PCR( partially Double stranded, Sterically
Hindered Primer – PCR). Η μέθοδος αυτή έχει αυξημένη ευαισθησία και ειδικότητα,
δεδομένου ότι δεν εξαρτάται από στάδια κατάτμησης με ένζυμα περιορισμού και
αντιδράσεις λιγάσης που αποτελούν μέρος των υπαρχόντων μεθόδων (όπως η LAMPCR).
Η μείζονα διαφορά ανάμεσα στην DSCP-PCR και στις προηγούμενες PCR
μεθόδους συνιστάται στο στάδιο της σύνδεσης της συμπληρωματικής αλυσίδας του DNA
όπου χρησιμοποιείται ένας εκκινητής που το ένα άκρο του είναι εκφυλισμένο ενώ το
άλλο αποτελείται από διπλή έλικα DNA. Η σχεδίαση αυτή τον καθιστά ικανό να
προσδένεται μόνο στο άκρο οποιασδήποτε μονής αλυσίδας. Η μέθοδος αυτή παράγει ένα
υψηλά πληροφοριακό σύνολο δεδομένων για τον χαρακτηρισμό των θέσεων
ενσωμάτωσης των φορέων. Επίσης μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη σύνθεση του προφίλ
των κλώνων που συμμετέχουν στην αιμοποίηση σε κάποια χρονική περίοδο. Η
παρακολούθηση το προφίλ αυτού μέσα στον χρόνο δίνει ενδείξεις για την κινητική της
αιμοποίησης και κατά συνέπεια της εμφάνιση νέων κλώνων.
Episomal vectors have been considered valid alternatives to viral vectors for gene
therapy applications, as they are replicating extrachromosomally and are devoid of the
adverse effect of insertional mutagenesis. Interest in the episomal systems was boosted
by the development of the pEPI-1 vector, containing the scaffold matrix attachment
region (S/MAR) element of the human beta-interferon gene, which confers to it stable
episomal status, without the need for transcription of any viral element. S/MARs are
heterogeneous DNA regions that attach to the nuclear matrix, participating in the
organization of the eukaryotic genome, initiation of DNA replication and regulation of
transcription. We decided to study the performance of the S/MAR element in a
completely different vector DNA context. Starting from vector pCEP4 (Invitrogen) based
on OriP EBV and EBNA-1 latent retention system, we constructed plasmids: (1)
pEBS/eGFP with SMAR element cloned after eGFP gene as in pEPI-1. (2)
pESdER/eGFP derived from pEBS/eGFP by deletion of EBNA-1 gene and (3)
pCEP4/eGFP as reporter plasmid. Contrary to expectations, only plasmid (3) was able to
establish stable Jurkat cell line cultures. Calculation of stress-induced duplex
destabilization of the above plasmids demonstrated a high threshold for the
destabilization of the OriP region, unlike the parental vector pCEP4, caused by the
energy competition of OriP with the highly destabilized S/MAR region. Substitution of
OriP in plasmid (2) with the β-globin initiation region (IR) (pESdER-IR/eGFP) results in
the restoration of episomal status, providing high mitotic stability without selection
pressure for up to 3 months of culture. We deduce that the replication potential of an
episomal system carrying an S/MAR element depends on the existence of highly
destabilized vector sequences, sufficient to counteract the S/MAR effect of stabilization
on vector’s DNA backbone molecule and maintain the plasmid’s accessibility to the
cellular replication machinery. Thus emerges the concept of including the calculation of
stress-induced duplex destabilization in the design of self-replicative extrachromosomal
units. The widespread use of retroviral-based vectors as gene transfer systems in the context of
gene therapy clinical trials has emerged the need for accurately assessing their safety
profile in order to identify the potential risks of insertional mutagenesis. Here we report a
new PCR - based method, DSHP-PCR ( partially Double stranded, Sterically Hindered
Primer – PCR), a clinically orientated method for analysing the integration sites with high
sensitivity and reliability, devoid of the restriction digestion and cloning bias present in
the existing methods. The difference between DSHP-PCR and previous PCR-based
methods (such as LAM-PCR) consists in the step of second strand synthesis where the
use of a partially double stranded –degenerated primer that binds at the end of the DNA
single strands bypasses the need for the restriction digestion step that inserts a bias in
integration site detection and for the cassette ligation step that renders the whole
procedure inefficient. This method generates a highly informative integration site library
used for the sequencing of the human genomic – retroviral junctions, by creating a PCR
product pool that contains a high percentage of specific fragments of similar length that
can be subcloned with the same efficiency in a sequencing vector. It can also be used for
the creation of the clonal composition profile of patient’s each cell lineage in time
allowing the monitoring of clonal kinetics of the haematopoietic or immune system by
detecting the emergence of new clones that contribute to haematopoiesis.
