Η χρήση ενδοφλέβιων καθετήρων είναι πλέον συνώνυμη με τις λοιμώξεις
που προκαλούνται από στελέχη S. epidermidis. Η ικανότητα του συγκεκριμένου
μικροοργανισμού να σχηματίζει βιομεμβράνες σχετίζεται άμεσα με την παθογένειά
του. Ορισμένες ερευνητικές ομάδες έχουν περιγράψει κάποιους από τους
μηχανισμούς σχηματισμού βιομεμβράνης καθώς και μόρια που συμμετέχουν σε
αυτούς. Η ερευνητική μας ομάδα έχει απομονώσει ένα όξινο, θειωμένο
πολυσακχαρίτη (20-kDa PS ή PS) ο οποίος φαίνεται να είναι ο κύριος αντιγονικός
καθοριστής της εξωκυττάριας βλεννώδους στιβάδας του S. epidermidis.
Αντισώματα έναντι αυτού του πολυσακχαρίτη έχει δειχθεί ότι προστατεύουν από
σταφυλοκοκκική κερατίτιδα, από νεογνική βακτηριαιμία ενώ ταυτόχρονα
διαχωρίζουν τα στελέχη S. epidermidis από τους υπόλοιπους πηκτάση-αρνητικούς
σταφυλοκόκκους.
Ένας από τους κύριους στόχους της παρούσας διατριβής ήταν η διερεύνηση
του ρόλου του PS στην προσκόλληση του S. epidermidis σε ενδοθηλιακά κύτταρα.
Για το λόγο αυτό χρησιμοποιήθηκαν ένα πρότυπο στέλεχος S. epidermidis που
παράγει τον PS (ΑΤCC35983) και ένα κλινικό στέλεχος το οποίο έχει δειχθεί ότι δεν
παράγει τον συγκεκριμένο πολυσακχαρίτη. Τα αποτελέσματα που ελήφθησαν
δείχνουν ότι ο PS διευκολύνει την προσκόλληση του S. epidermidis στα
ενδοθηλιακά κύτταρα με δοσοεξαρτώμενο τρόπο. Παρά το γεγονός ότι ο ακριβής
μηχανισμός προσκόλλησης δεν έχει βρεθεί, εντούτοις μπορεί να συσχετισθεί με το
μηχανισμό πρόσδεσης των σταφυλοκόκκων μέσω των αλυσίδων
γλυκοσαμινογλυκανών στα στελέχη που παράγουν τον πολυσακχαρίτη. Σε ό,τι
αφορά τα στελέχη που δεν παράγουν τον PS ο προαναφερόμενος μηχανισμός
συμμετέχει μερικώς στην προσκόλληση του S. epidermidis.
Ο δεύτερος στόχος της παρούσας μελέτης ήταν να διερευνηθεί κατά πόσο
μεταβάλλεται η έκφραση ορισμένων μακρομορίων του εξωκυττάριου χώρου διότι
είναι γνωστό ότι οι πρωτεογλυκάνες της κυτταρικής επιφάνειας συμμετέχουν στην
προσκόλληση του S. epidermidis σε ενδοθηλιακά κύτταρα. Για το σκοπό αυτό
χρησιμοποιήθηκαν τέσσερα στελέχη S. epidermidis που διέφεραν τόσο ως προς το
φαινότυπο όσο και ως προς τον γονότυπο. Τα αποτελέσματα που ελήφθησαν
έδειξαν ότι δεν υπάρχουν σημαντικές μεταβολές στην έκφραση των δύο κύριων
πρωτεογλυκανών των ενδοθηλιακών κυττάρων, συνδεκάνης-1 και γλυπικάνης-1,
σε κανένα από τα χρονικά διαστήματα που χρησιμοποιήθηκαν. Εντούτοις, τα
αποτελέσματα δεν μπορούν να αποκλείσουν τη λειτουργία των πρωτεογλυκανων
202
ως γέφυρες που διευκολύνουν την πρόσδεση και τη μετέπειτα είσοδο του S.
epidermidis στα ενδοθηλιακά κύτταρα.
Έχει δειχθεί ότι το ενδοθήλιο διαδραματίζει σημαντικό ρόλο σε περιπτώσεις
λοιμώξεων καθώς πραγματοποιείται ενεργοποίηση της έκφρασης ενός ευρέως
φάσματος μορίων προσκόλλησης και εξωκυττάριου χώρου. Στην παρούσα μελέτη
διερευνήθηκαν και αξιολογήθηκαν τα ειδικά προφίλ έκφρασης τέτοιων μορίων
μέσω Real-Time PCR, ELISA, ανοσοφθορισμού και ζυμογραφίας. Τα αποτελέσματα
που ελήφθησαν δείχνουν ότι αν και η γενική απόκριση των ενδοθηλιακών
κυττάρων σε περιπτώσεις λοιμώξεων με στελέχη S. epidermidis είναι να
αποικοδομήσουν τον εξωκυττάριο χώρο, τα γονίδια που ενεργοποιούνται είναι
διαφορετικά και έχουν σχέση με τα στελέχη που χρησιμοποιούνται. Φαίνεται ότι τα
ενδοθηλιακά κύτταρα προσπαθούν να μειώσουν τη συνοχή του εξωκυττάριου
χώρου έτσι ώστε να διευκολύνουν την μετακίνηση ουδετεροφίλων στο σημείο της
λοίμωξης. Μελλοντικές μελέτες στις οποίες θα χρησιμοποιηθούν γενετικά
τροποποιημένα βακτηριακά στελέχη σε συν-καλλιέργειες ενδοθηλιακών κυττάρων
με μακροφάγα ή μονοκύτταρα θα διευκρινήσουν τις αλληλεπιδράσεις που
πραγματοποιούνται in vivo.
The use of intravenous catheters and other medical implanted devices is
synonymous to Staphylococcus epidermidis infections. The ability of the specific
microorganism to cause infections is directly related to its ability to form biofilms.
Some of the mechanisms and molecules participating in the formation of biofilm
have been elucidated. Our research group has isolated an acidic, sulfated
polysaccharide (20-kDa PS or PS) that appear to be the main antigenic component
of S. epidermidis extracellular mucous layer. Antibodies against this polysaccharide
protect from staphylococcal keratitis, neonate bacteremia and discriminate S.
epidermidis strains from other CoNS.
In the present dissertation one of the major goals was to evaluate the role
of PS in S. epidermidis’ adherence to human endothelial cells. A PS reference
strain (ATCC35983) and a non-PS producing clinical strain were used. Results
obtained showed that PS facilitates S. epidermidis’ adherence to endothelial cells
in a dose dependent manner. Although the fine mechanism for such a binding is not
as yet clear, it may be correlated with the staphylococcal binding through
glycasaminoglycan chains at least for the strains that produce this polysaccharide.
As long as the non-PS producing strains are concerned the involvement of the
above mentioned mechanism has partial contribution to S. epidermidis adherence.
Considering that cell surface proteoglycans are involved in S. epidermidis
adherence to endothelial cells, the second major goal of this study was to examine
whether gene expression of certain matrix biomacromolecules is modified in S.
epidermidis infected endothelial cells as compared to non-infected ones. Four
different phenotypically and genotypically strains were used. Results show no
significant difference in expression of two main cell-surface proteoglycans,
syndecan-1 and glypican-1, in all time points and for all strains used. These results,
however, cannot exclude that proteoglycans may be the bridge facilitating S.
epidermidis adherence and subsequently invasion to endothelial cells.
It has been established that endothelium plays a crucial role in
inflammation. This is achieved by the consequent expression of a wide variety of
adhesion and extracellular matrix molecules. In the present study, the specific
expression profile of such molecules was also evaluated using Real-Time PCR,
ELISA, immunofluorescence and zymography. Obtained results indicate that, even
though the general reaction of endothelial cells is to disintegrate the structure of
the extracellular matrix, the genes activated are different with respect to the
204
strains that were used. It seems that the endothelial cells’ effort to decrease the
extracellular matrix cohesion is a way to facilitate migration of macrophages at the
site of infection. Future studies using genetically modified bacterial strains in cocultures
of endothelial cells with macrophages or monocytes will elucidate the
interactions that actually happen in vivo.
