Σκοπός/Εισαγωγή.Πολλές μελέτες έχουν προτείνει ότι η ανοσιακή απόκριση παίζει
σημαντικό και καθοριστικό ρόλο στην δημιουργία καθώς και στην εξέλιξη του
ηπατοκυτταρικού καρκίνου (ΗΚΚ), αλλά υπάρχει έλλειψη κατάλληλων πειραματικών
μοντέλων βασισμένων στα ανθρώπινα ηπατοκύτταρα έτσι ώστε να μελετηθούν με
επιτυχία οι υποκείμενοι μηχανισμοί. Επομένως, ο στόχος μας ήταν να
δημιουργήσουμε (α) ένα λειτουργικό σύστημα καλλιέργειας πρωτοταγών ανθρώπινων
ηπατοκυττάρων από ασθενείς με ΗΚΚ και (β) ένα σύστημα συγκαλλιέργειας
ανθρώπινων καρκινικών και μη-καρκινικών ηπατοκυττάρων με αυτόλογα μονοπύρηνα
κύτταρα του περιφερικού αίματος με σκοπό να μελετήσουμε τις in vitro κυτταρικές
αλληλεπιδράσεις τους.
Μεθοδολογία.Καρκινικά (όγκος) και μη-καρκινικά (πέριξ του όγκου) ηπατοκύτταρα
απομονώθηκαν από ιστοτεμάχια ήπατος τα οποία προέρχονταν από 11 ασθενείς με ΗΚΚ
που υποβλήθηκαν σε μερική ηπατεκτομή, με υποκείμενη νόσο, ένω η λήψη του
αυτόλογου περιφερικού αίματος πραγματοποιήθηκε πριν την ηπατεκτομή. Επίσης,
πραγματοποιήθηκε λήψη 4 βιοψιών και αυτόλογου περιφερικού αίματος, από ασθενείς
χωρίς ηπατική νόσο, οι οποίοι χειρουργήθηκαν για καλοήθεις όγκους του ήπατος
(φυσιολογικά, υγειή ηπατοκύτταρα). Τα ηπατοκύτταρα είτε καλλιεργήθηκαν μόνα
τους (μονοκαλλιέργεια/ομάδα ελέγχου), είτε συγκαλλιεργήθηκαν με τα περιφερικά
μονοπύρηνα κύτταρα. Η έκφραση των MHC τάξης II μορίων, της απόπτωσης, της
νέκρωσης και της βιωσιμότητας (7-AAD/7-αντινομυκίνη-D) (ηπατοκύτταρα και
περιφερικά μονοπύρηνα) πραγματοποιήθηκαν με κυτταρομετρία ροής μετά την
απομόνωση, πριν τη συγκαλλιέργεια και 24, 48 και 72 ώρες μετά τη συγκαλλιέργεια
και στις μονοκαλλιέργειες.
Αποτελέσματα.Τα καρκινικά και μη-καρκινικά ηπατοκύτταρα παρουσίασαν αυξημένη
έκφραση των MHC τάξης II μορίων στις 48 και 72 ώρες συγκαλλιέργειας με τα
περιφερικά μονοπύρηνα κύτταρα συγκριτικά με τις μονοκαλλιέργειες. Στις 72 ώρες
τα καρκινικά ηπατοκύτταρα που έκφραζαν MHC-II είχαν αυξημένη βιωσιμότητα. Τα
περιφερικά μονοπύρηνα κύτταρα παρουσίασαν αυξημένη έκφραση MHC-II
(ενεργοποίηση) στη συγκαλλιέργεια με τα καρκινικά ηπατοκύτταρα σε σχέση με τις
αντίστοιχες μη-καρκινικές συγκαλλιέργειες σε όλες τις χρονικές στιγμές. Τα
CD8+ Τ κύτταρα είχαν σημαντικά αυξημένη απόπτωση και νέκρωση στις 48 ώρες
συγκαλλιέργειας με τα καρκινικά ηπατοκύτταρα σε σύγκριση με τις
μονοκαλλιέργειες. Ενδιαφέρον είχε ότι η έκφραση των MHC-II τόσο στα καρκινικά
όσο και στα μη-καρκινικά ηπατοκύτταρα είχε θετική συσχέτιση με τα αντίστοιχα
ενεργοποιημένα CD8+MHC-II+ Τ λεμφοκύτταρα.
Συμπεράσματα.Δημιουργήσαμε, για πρώτη φορά, ένα in vitro μοντέλο
συγκαλλιέργειας μεταξύ των αυτόλογων περιφερικών μονοπύρηνων κυττάρων και των
πρωτοταγών καρκινικών και μη-καρκινικών ηπατοκυττάρων. Η άμεση αλληλεπίδραση
τους οδηγεί σε αύξηση της αντιγονοπαρουσιαστικής ικανότητας των καρκινικών
ηπατοκυττάρων με ταυτόχρονη απόπτωση των ενεργοποιημένων CD8+ Τ κυττάρων.
Παρόλο που υπάρχει μερικώς δραστική ανοσιακή απάντηση κατά των καρκινικών
ηπατοκυττάρων, αυτά καταφέρνουν να διαφύγουν της ανοσιακής επίθεσης.
(EL)
Background: Many studies have suggested that the immune response may play a
crucial role in the progression of hepatocellular carcinoma (HCC). Therefore,
our aim was to establish a (i) functional culture of primary human tumor
hepatocytes and non-tumor from patients with hepatocellular carcinoma (HCC) and
(ii) a co-culture system of HCC and non-HCC hepatocytes with autologous
peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) in order to study in vitro
cell-to-cell interactions.
Methods: Tumor (HCC) and non-tumor (non-HCC) hepatocytes were isolated from the
liver resection specimens of 11 patients operated for HCC, while PBMCs were
retrieved immediately prior to surgery. Four biopsies were obtained from
patients with no liver disease who had surgery for non malignant tumor (normal
hepatocytes). Hepatocytes were either cultured alone (monoculture) or
co-cultured with PBMCs. Flow cytometry measurements for MHC class II
expression, apoptosis, necrosis and viability (7AAD) were performed 24 h, 48 h
and 72 h in co-culture and monocultures.
Results: HCC and non-HCC hepatocytes exhibited increased MHC-II expression at
48h and 72h in co-culture with PBMCs as compared to monoculture, with MHC
II-expressing HCC hepatocytes showing increased viability at 72 h. PBMCs showed
increased MHC-II expression (activation) in co-culture with HCC as compared to
non-HCC hepatocytes at all time points. Moreover, CD8+ T cells had
significantly increased apoptosis and necrosis at 48h in co-culture with HCC
hepatocytes as compared to monocultures. Interestingly, MHC-II expression on
both HCC and
non-HCC hepatocytes in co-culture was positively correlated with the respective
activated CD8+ T cells.
Conclusions: We have established an in vitro co-culture model to study
interactions between autologous PBMCs and primary HCC and non-HCC hepatocytes.
This direct interaction leads to increased antigen presenting ability of HCC
hepatocytes, activation of PBMCs with a concomitant apoptosis of activated CD8+
T cells. Although, a partially effective immune response against HCC exists,
still tumor hepatocytes manage to escape.
(EN)
