Το L-ασκορβικό οξύ (Βιταμίνη C) είναι απαραίτητος μεταβολίτης στα ζωικά και φυτικά κύτταρα εξαιτίας του ρόλου του ως συμπαράγοντας ενζύμων και της αντιοξειδωτικής του δράσης. Στα περισσότερα ευκαρυωτικά κύτταρα το L-ασκορβικό οξύ συντίθεται μέσα από μια σειρά ενζύμων από μονοσακχαρίτες. Τα περισσότερα Πρωτεύοντα, συμπεριλαμβανομένου και του ανθρώπου, και κάποια άλλα ζώα έχουν χάσει την ικανότητα σύνθεσης λόγω γενετικών ελλείψεων στο γονίδιο της L-gulonolactone οξειδάσης. Η μεταφορά του ασκορβικού στους ιστούς γίνεται μέσω εξειδικευμένων μεταφορέων (SVCT-1/2) οι οποίοι είναι απαραίτητοι για την επιβίωση. Οι SVCT-1/2 ανήκουν σε μια από τις εκτενέστερα χαρακτηρισμένες οικογένειες μεταφορέων που ονομάζεται NAT (Nucleobase Ascorbate Transporters). Το πρότυπο μέλος της οικογένειας ΝΑΤ είναι ο μεταφορέας UapA (uric acid-xanthine permease του μύκητα Aspergillus nidulans) που έχει μελετηθεί εκτενώς σε επίπεδο ρύθμισης της έκφρασης, υποκυτταρικής μεταφοράς, αποδόμησης και σχέσεων δομής λειτουργίας. Στην παρούσα εργασία εξετάζεται η μοριακή βάση της εξειδίκευσης υποστρώματος των ΝΑΤ, και συγκεκριμένα η εξέλιξη της ικανότητας μεταφοράς του ασκορβικού. Μέσω ορθολογικού σχεδιασμού και λειτουργικής ανάλυσης μεταλλαγμένων μορφών του UapA εντοπίσαμε ένα μοτίβο, αποτελούμενο από 4 αμινοξέα, μέσα στη θέση δέσμευσης υποστρώματος, το οποίο διαφοροποιεί την ικανότητα μεταφοράς βάσεων και ασκορβικού. Προκαταρκτικές φυλλογενετικές ενδείξεις προτείνουν ότι οι μεταφορείς ασκορβικού εξελίχθηκαν στα ψάρια. Επιπρόσθετα, δημιουργήσαμε ένα στέλεχος A. nidulans που έχει χάσει την ικανότητα να συνθέτει D-έρυθροασκορβικό οξύ, ενός μεταβολίτη που υπάρχει στους μύκητες και φαίνεται να έχει ανάλογο ρόλο με αυτόν του ασκορβικού. Το στέλεχος αυτό αναμένεται να χρησιμοποιηθεί ως εργαλείο για την αναγνώριση των μεταλλαγμένων μορφών του UapA που μεταφέρουν ασκορβικό. Τα αποτελέσματα μας θα συζητηθούν υπό το πρίσμα της εξέλιξης της εξειδίκευσης των μεταφορέων.
(EL)
L-ascorbic acid (vitamin C) is an essential metabolite in animals and plants due to its role as an enzyme co-factor and antioxidant activity. In most eukaryotic organisms, L-ascorbic acid is biosynthesized enzymatically from monosaccharides1. Most primates, including humans, and some animals have lost the capacity of ascorbic acid biosynthesis due to truncations in the gene coding for L-gulonolactone oxidase. Specific ascorbate transporters (SVCT-1/2), necessary for ascorbate tissue redistribution, are essential for life in mammalian and plant cells. SVCT-1/2 belong to one of the best characterized transporter families, called Nucleobase-Ascorbate Transporters (NAT). The prototype member of NAT family, called UapA (uric acid-xanthine permease of the fungus Aspergillus nidulans) has been extensively studied in respect to regulation of expression, subcellular traffic, turnover and structure-function relationships2,3. Here, we investigate the molecular basis underlying NAT substrate specificity, and in particular, how ascorbate specificity has evolved from nucleobase transporters. Through rational design and functional analysis of UapA mutants we have identified a four-aminoacid motif, within the substrate binding site, which is critical for nucleobase and/or ascorbate transport. Phylogenetic analysis was also used to identify the ‘ancestral’ origin of the ascorbate-specific version of this motif. Preliminary evidence thus suggests that ascorbate transporters evolved in fish. Additionally, we constructed A. nidulans mutant strains lacking the ability to synthesize D-erythroascorbic acid(aloAΔ), a fungal metabolite presenting roles analogous to L-ascorbic acid. This strain is expected to serve as a tool in the functional characterization of UapA mutants specific for L-ascorbic acid. Our results will be discussed within the frame on how novel functions and substrate specificities are generated in the course of evolution.
(EN)
