In vitro και in vivo μελέτες για τη διερεύνηση του ρόλου του οξειδωτικού στρες στη διαφοροποίηση μυοκαρδίου χρησιμοποιώντας κυτταρικές σειρές και το ζωικό μοντέλο zebrafish (Danio rerio)

Κουφάκη Μαρία (EL)

Koufaki Maria (EN)

Το υδρόθειο (H2S) είναι ένα άχρωμο, εύφλεκτο αέριο και στο παρελθόν ήταν ευρέως γνωστό για την τοξικότητα του. Τα τελευταία χρόνια έχει αναγνωριστεί́ ο ρόλος του ως ένα σηματοδοτικό́ μόριο που συντίθεται από τους ζωντανούς οργανισμούς και αποτελεί το τρίτο μέλος της οικογένειας των αέριων διαβιβαστών. Μία από τις κύριες πηγές ενδογενούς ενζυματικής παραγωγής υδρόθειου είναι το μονοπάτι του 3-μερκατοπυροσταφυλικού (3-ΜΡ)/ θειομεταφοράση του 3-μερκαπτοπυροσταφυλικού (3-MST). Το zebrafish είναι ένα ζωικό μοντέλο που προσφέρει πολλά πλεονεκτήματα έναντι των θηλαστικών όσον αφορά τη μελέτη της ανάπτυξης των σπονδυλωτών και τη μοντελοποίηση των ανθρώπινων ασθενειών. Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήσαμε μία σειρά zebrafish που έχει υποστεί στοχευμένη μεταλλαξιγένεση στο ορθόλογο γονίδιου του 3-MST μέσω του συστήματος CRISPR/Cas9 και πραγματοποιήσαμε συμπεριφορικές και χημικές δοκιμές με σκοπό τον χαρακτηρισμό παθολογικού φαινοτύπου, καθώς τα ομόζυγα για το μεταλλαγμένο αλληλόμορφο έμβρυα αναπτύσσονται φυσιολογικά. Οι 3-mst-/- προνύμφες εμφανίζουν αρρυθμίες, μειωμένο καρδιακό παλμό και αυξημένα ποσοστά θνησιμότητας σε σχέση με τις αγρίου τύπου προνύμφες κάτω από συνθήκες οξειδωτικού στρες που επάγονται με το γνωστό ζιζανιοκτόνο παρακουάτ. Επίσης, παρατηρήσαμε στα μεταλλαγμένα έμβρυα έντονη απόκριση θιγμοτακτισμού και ευαισθησία σε ουσίες οι οποίες επάγουν συμπεριφορά που προσομοιάζει με άγχος. Τα αποτελέσματα μας υποστηρίζουν πως η συγκεκριμένη σειρά έχει την προοπτική να αποτελέσει χρήσιμο εργαλείο για τη διερεύνηση των φυσιολογικών ρόλων του 3-MST και των μοριακών μηχανισμών με τους οποίους αυτό δρα, με πιθανή αντιστοίχιση αυτών στον ανθρώπινο οργανισμό. Παράλληλα, στο πλαίσιο της συγκεκριμένης εργασίας μελετήσαμε τον ρόλο της θυρεοειδικής ορμόνης Τριιωδοθυρονίνης (Τ3) στον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση καρδιακών μυοβλαστών H9c2. Πειράματα ανοσοκυτταροχημείας αποκάλυψαν πως η Τ3 ενισχύει την πολλαπλασιαστική ικανότητα των H9c2 κυττάρων καθώς παρατηρήσαμε αυξημένη κατά 48% σήμανση με BrdU στη συνθήκη χορήγησης ορμόνης σε σχέση με τα κύτταρα ελέγχου. Απώτερο σκοπό της μελέτης αποτελεί η διευκρίνιση του τρόπου δράσης της Τ3 στη φυσιολογία των καρδιομυοκυττάρων, προκειμένου να αποτελέσει ένα νέο θεραπευτικό παράγοντα αντιμετώπισης του εμφράγματος μυοκαρδίου και άλλων καρδιαγγειακών νοσημάτων στον άνθρωπο. (EL)

Hydrogen sulfide (H2S) is a colorless, flammable gas with the characteristic smell of rotten eggs. H2S has profound biological effects within living organisms and is now increasingly being considered as the third member of the gasotransmitter family. One major source for endogenous intramitochondrial production of H₂S is the 3-mercaptopyruvate (3-MP) / 3-mercaptopyruvate sulfurtransferase (3-MST) pathway. Zebrafish offers several advantages over mammalian model organisms for the study of vertebrate development and pathophysiology. These include: high fecundity, rapid and external development of transparent embryos, genetic tractability and remarkable regenerative capacity during both embryonic and adult stages. In the present study, we use a zebrafish line where we induced via a CRISPR mediated approach, a targeted mutation in the orthologue gene of 3-MST. 3-mst-/- embryos appear morphologically normal and we are therefore testing their tolerance under different stress conditions (i.e. chemically induced hypoxia via cobalt chloride or mitochondrial damage via paraquat). Mutant larvae show arrhythmias, a reduced heartbeat and an increased mortality rate when compared to wild type larvae following paraquat treatment. In addition, we observed induced anxiety-like behavior in mutant embryos measured by a thigmotaxis assay both in physiological conditions and when treated with the anxiogenic drug rolipram. Furthermore, we studied the ability for cardiac regeneration of the 3-mst mutant line in early developmental stages, by inducing non-invasively myocardial cell damage. These approaches will help us generate a 3-MST model that could potentially provide a detailed picture of how this enzyme functions and its role in diseases. An additional aim of this study was to determine whether the thyroid hormone Triiodothyronine (T3) has a putative role in the proliferation or the differentiation of H9c2 myoblasts. Cell immunofluorescent microscopy showed that T3 significantly promoted the H9c2 proliferation as we identified a ~48% increase in BrdU staining compared to the control cells. Our final purpose is to uncover the T3-induced mechanisms in cardiomyocyte physiology in order to provide a therapeutic opportunity for promoting cardiac repair in patients with acute myocardial infarction and other cardiovascular diseases. (EN)

born_digital_graduate_thesis

Πτυχιακή Εργασία (EL)

Graduate Thesis (EN)

Θετικές Επιστήμες (EL)

Science (EN)

Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών

Πέργαμος

Πτυχιακή Εργασία

Ελληνική γλώσσα

2017

https://pergamos.lib.uoa.gr/uoa/dl/object/uoadl:2005318

uoadl:2005318