Η γνώση της δομής των συμπλόκων που εμφανίζουν βιολογική δραστικότητα αποτελεί ένα σημαντικό βήμα για την καλύτερη κατανόηση τόσο της δικής τους λειτουργικής συμπεριφοράς όσο και των μηχανισμών ρύθμισης των βιολογικών μονοπατιών στα οποία συμμετέχουν. Η πρόσβαση σήμερα σε τελευταίας τεχνολογίας εργαλεία βιοπληροφορικής ανάλυσης, έχει διευρύνει κατά πολύ τη μελέτη των βιομοριακών αλληλεπιδράσεων, ακόμα και όταν δεν υπάρχει η ακριβής γνώση για τη στερεοδιάταξη κάποιου μακρομορίου. Πλέον, μέσω μοριακών προσομοιώσεων, μπορούν να παραχθούν ρεαλιστικές αρχιτεκτονικές μορίων και συμπλόκων με βιοχημικό ενδιαφέρον για ένα μεγάλο εύρος φυσικοχημικών συνθηκών.
Σκοπός της παρούσας διπλωματικής εργασίας είναι η δομική μελέτη της αλληλεπίδρασης της καλμοδουλίνης (CaM), με συγκεκριμένες περιοχές του υποδοχέα ρυανοδίνης τύπου-2 [RyR2] (ΠεπτίδιοΒ και ΠεπτίδιοF), που με βάση τη βιβλιογραφία αποτελούν τις κύριες περιοχές πρόσδεσης της CaM στον RyR2. Ο μηχανισμός αλληλεπίδρασης και ρύθμισης της CaM/RyR2 δεν είναι πλήρως κατανοητός, κυρίως εξαιτίας της απουσίας δομικής πληροφορίας σχετικά με τον RyR2, αν και από τα μέχρι τώρα ερευνητικά δεδομένα είναι γνωστό ότι δρα ως μοριακός διακόπτης στο κανάλι απελευθέρωσης Ca2+ από το Σαρκοπλασματικό Δίκτυο (ΣΔ), διαδραματίζοντας βασικό ρόλο στο μηχανισμό σύζευξης διέγερσης-συστολής του καρδιακού μυ και κατ’ επέκταση του καρδιακού παλμού.
Επιπρόσθετα, καινούργια ερευνητικά δεδομένα κάνουν λόγο για τον εντοπισμό 17 μεταλλάξεων στα γονίδια που κωδικοποιούν την CaM (CALM1,CALM2 και CALM3), κυρίως σε νεαρούς ασθενείς με καρδιακές δυσλειτουργίες που ξεκινούν από σοβαρές αρρυθμίες και φτάνουν μέχρι και τη καρδιακή ανεπάρκεια. Ο μοριακός μηχανισμός που ευθύνεται για την εμφάνιση τέτοιων φαινοτύπων παραμένει άγνωστος και συνεπώς υπάρχει ανάγκη για την αποσαφήνιση του τρόπου επίδρασης των μεταλλαγμάτων της CaM στους μηχανισμούς ομοιόστασης Ca2+ των καρδιακών κυττάρων. Μέχρι σήμερα υπάρχουν τρία πιθανά σενάρια για την επίδραση των μεταλλαγμάτων της CaM, που αφορούν είτε τη μεταβολή στο βαθμό συγγένειας της CaM για τον RyR2, είτε τη μεταβολή της συγγένειας της CaM για τα ιόντα Ca2+, ενώ τέλος γίνεται λόγος για σοβαρές επιπτώσεις στη θερμοσταθερότητα του συμπλόκου CaM/RyR2.
Για την επίτευξη όλων των παραπάνω στόχων και τη μελέτη όλων των πιθανών σεναρίων, πραγματοποιούνται προσομοιώσεις αγκυροβόλησης (docking) σε περιοχές-κλειδιά της διεπιφάνειας αλληλεπίδρασης CaM/RyR2 και γίνεται αξιολόγηση των συμπλόκων που προέκυψαν. Επίσης, πραγματοποιείται με κατάλληλα εργαλεία η de novo σύνθεση των πεπτιδίων B και F του υποδοχέα RyR2 και γίνεται ανάλυση των φυσικοχημικών τους χαρακτηριστικών. Τέλος, μέσω εξειδικευμένων προγραμμάτων μοριακής δυναμικής, κατασκευάζονται μοντέλα μεταλλαγμένων μορφών καλμοδουλίνης με στόχο τη μελέτη της επίδρασης τους στη δομή και στη δραστικότητα του μορίου.
Όλα τα αποτελέσματα που προκύπτουν συγκρίνονται με συμπεράσματα τόσο από πρόσφατες πειραματικές μελέτες όσο και από τα υπάρχοντα θεωρητικά πλαίσια για το σχηματισμό του συμπλόκου CaM/RyR2. Με βάση τα ευρήματα αυτά, παρουσιάζεται ένα καινούργιο δομικό μοντέλο για τη ρύθμιση του ανθρώπινου RyR2 καθώς και σύνδεση συγκεκριμένων δομικών μεταβολών στο μόριο της CaΜ με παθολογικές καταστάσεις.
(EL)
For complexes with biological activity, structural information is an important step towards a better understanding of both their functional behavior and mechanisms of regulation of their corresponding biological pathways. Nowdays, access to state-of-the-art bioinformatic tools, has greatly expanded the study of biomolecular interactions, even without any prior knowledge of their exact conformation. Today, through molecular simulations, realistic molecules and complexes of biochemical interest can be produced for a wide range of physicochemical conditions.
The scope of this master thesis is the structural study of the interaction of calmodulin (CaM) with specific regions of the type 2 ryanodine receptor [RyR2] (Peptide B and Peptide F), which according to the literature are the main binding sites of CaM in RyR2. The molecular mechanism of interaction and regulation of CaM/Ry2 is not fully understood, mainly due to the absence of structural information about RyR2. Data so far have shown that RyR2 acts as a molecular switch on the Ca2+ release channel of the Sarcoplasmic Reticulum (SR), having an important role in the excitation-contraction coupling mechanism of the cardiac muscle and hence the heartbeat.
In addition, recent research data identified 17 mutations in genes encoding CaM (CALM1, CALM2 and CALM3), mainly in young patients with cardiac dysfunctions including severe arrhythmias and heart failure. The molecular mechanism giving rise to such phenotypes remains unknown and therefore there is a need to clarify the effect of CaM mutants on Ca2+ homeostasis mechanisms of heart cells. To date, there are three propable scenarios for the effect of CaM mutants: 1) either a drastic change in CaM affinity for RyR2, 2) a drastic change for the Ca2+ ions binding affinity in CaM, or 3) a significant change in the thermodynamic stability of the CaM.
To fully explore all possible scenarios, docking simulations were performed in key areas of the CaM/RyR2 interaction interface and evaluation of the resulting complexes was made. Furthermore, de novo synthesis of RyR2 peptides B and F was performed with proper bioinformatic tools followed by analysis of their physicochemical characteristics. Finally, structural models of calmodulin mutations were constructed via specialized molecular dynamics programs, in order to study their effect on both structure and activity of the molecule.
All findings were compared to recent experimental results and existing theoretical frameworks on the conformation of the CaM/RyR2 complex to validate the conclusions of this study. As a result, a new structural model is poposed for the regulation of human RyR2 as well as associating specific biophysicall changes of CaM with pathological conditions.
(EN)
