Σε αυτή τη διατριβή πραγματοποιήθηκε η ανάπτυξη και επικύρωση μεθόδων για τον
προσδιορισμό της σουλφαδιαζίνης (SDZ) και της τριμεθοπρίμης (TMP), καθώς και
του κύριου μεταβολίτη της σουλφαδιαζίνης, της ακετυλο-σουλφαδιαζίνης (AcSDZ),
με εσωτερικό πρότυπο τη δαπσόνη (DPS), σε ιστούς καλλιεργούμενων ιχθύων, όπως η
σάρκα με δέρμα σε φυσική αναλογία, το ήπαρ και ο ορός. Οι δραστικές ουσίες SDZ
και TMP είναι εγκεκριμένες στην Ελλάδα για χρήση τους στις ιχθυοκαλλιέργειες.
Χρησιμοποιούνται συνήθως, σε αναλογία SDZ:TMP 5:1, τόσο για λόγους προώθησης
της ανάπτυξης, όσο και για λόγους προφύλαξης και θεραπείας έναντι πολλών
βακτηριακών, κυρίως, νοσημάτων.
Η ευρεία χρήση των αντιβιοτικών οδηγεί στην παρουσία καταλοίπων στους ιστούς
των ιχθύων, με αποτέλεσμα να προκύπτουν κίνδυνοι για την υγεία των καταναλωτών.
Έτσι, στις μεθόδους που αναπτύχθηκαν και επικυρώθηκαν, χρησιμοποιήθηκε η
τεχνική Υγροχρωματογραφίας-Φασματομετρίας μαζών (Liquid Chromatography-Mass
Spectrometry, LC/MS), η οποία με την υψηλή ευαισθησία και την εκλεκτικότητα που
έχει, επιτρέπει την ανίχνευση και τον ποσοτικό προσδιορισμό των ουσιών σε
συγκεντρώσεις πολύ χαμηλότερες από τα Ανώτατα Όρια Καταλοίπων (Maximum Residue
Limits, MRLs) που έχει θέσει η Ευρωπαϊκή Ένωση (E.E.). Η παρουσία των ουσιών σε
συγκεντρώσεις κάτω από τα MRLs θεωρείται «ασφαλής» για την υγεία των
καταναλωτών. Το MRL για το σύνολο των σουλφοναμιδίων (SAs) είναι 100 μg kg-1
και για την TMP 50 μg kg-1 σάρκας με δέρμα.
Για τον χρωματογραφικό διαχωρισμό των αναλυτών και του εσωτερικού προτύπου
χρησιμοποιήθηκε Υγροχρωματογραφικό Σύστημα Υψηλής Απόδοσης με αναλυτική στήλη
XTerra MS C18 (100,02,1 mm, 3,5 μm), θερμοστατούμενη στους 40 oC. Εφαρμόστηκε
πρόγραμμα βαθμιδωτής έκλουσης στην κινητή φάση, η οποία αποτελείτο από ύδωρ και
ακετονιτρίλιο με μυρμηκικό οξύ 0,05 % (v/v) και είχε ροή 0,2 mL min-1. Ως
ανιχνευτής χρησιμοποιήθηκε το φασματόμετρο μαζών, μοντέλο ZQ 2000, επιλέγοντας
τη μέτρηση θετικών (πρωτονιωμένων) ιόντων των υπό μελέτη ουσιών.
Για την κατεργασία των δειγμάτων σάρκας με δέρμα και ήπατος χρησιμοποιήθηκε το
Σύστημα Επιταχυνόμενης Εκχύλισης, με το ύδωρ ως διαλύτη εκχύλισης, ο δε
καθαρισμός έγινε με χρήση των στηλών Εκχύλισης Στερεάς Φάσης Abselut Nexus 60
mg /3 mL. Για την κατεργασία των δειγμάτων ορού πραγματοποιήθηκε Yγρό-υγρό
Eκχύλιση με οξικό αιθυλεστέρα και περαιτέρω καθαρισμός με n-εξάνιο.
Οι μέθοδοι επικυρώθηκαν σύμφωνα με την Απόφαση 2002/657/ΕΚ της Ευρωπαϊκής
Κοινότητας και χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης των SDZ,
TMP και AcSDZ στους ιστούς τσιπούρας, μετά από βιολογικό πειραματισμό με δύο
διαφορετικές τροφές. Τέλος, υπολογίστηκε ο χρόνος αποδρομής των (Withdrawal
time, Wt), στις δύο περιπτώσεις, με το στατιστικό πρόγραμμα WT1.4.
(EL)
This thesis describes the development and validation of methods for the
determination of sulfadiazine (SDZ), trimethoprim (TMP), and
acetyl-sulfadiazine (AcSDZ), the main metabolite of SDZ, with dapsone as
internal standard, in tissues of cultured fish, like muscle plus skin in
natural proportion, liver and serum. In Greece, both SDZ and TMP are approved
drugs for use in aquaculture. They are usually used in a ratio SDZ:TMP of 5:1,
for the promotion of growth and for prophylactic and therapeutic purposes
mainly against bacteria diseases.
The wide use of antibiotics in aquaculture results in the presence of drug
residues in fish tissues, that can have undesirable effects on consumer health.
Liquid Chromatography-Mass Spectrometry with high sensitivity and selectivity
was used for the detection and quantitation of residues in concentrations below
the Maximum Residue Limits (MRLs) which have been set by the European Union.
The levels below MRLs are considered to be safe on consumer health. The MRL for
the sum of sulfonamides has been set to 100 μg kg-1 and for TMP 50 μg kg-1 in
muscle plus skin.
Analysis was performed by using High Performance-Liquid Chromatographic system
and the analytical column XTerra MS C18 (100,02,1 mm, 3,5 μm) kept at 40 oC.
The mobile phase was consisted of water and acetonitrile, both solvents
containing formic acid 0,05 % (v/v), and was pumped at a programme of gradient
elution and a constant flow rate of 0,2 mL min-1. The detection of analytes and
internal standard was performed by using the Mass Spectrometric system model ZQ
2000, monitoring the positive (protonated) ions of the drugs.
Extraction of drugs from muscle plus skin and liver samples was carried out by
using water in Accelerated Solvent Extraction. Abselut Nexus 60 mg /3 mL Solid
Phase Extraction cartridges were used for sample cleanup. Liquid-liquid
extraction with ethyl acetate and cleanup with n–hexane were used for serum
sample preparation.
The methods were validated according to the 2002/657/EC European Decision and
were used for the determination of SDZ, TMP and AcSDZ in tissues of gilthead
seabream after a two diet trial. Withdrawal times (Wts) of the drugs were
calculated by WT1.4 software.
(EN)
