Ενώ η πλειονότητα των ευκαρυωτικών οργανισμών αναπαράγονται μεφυλετικό τρόπο, υπάρχει μια μικρή κατηγορία διαφορετικών και ενδιαφερόντωνοργανισμών που παρεκκλίνουν από το γενικό κανόνα, καθώς αναπαράγονταιχρησιμοποιώντας εναλλακτικούς τρόπους. Εν συντομία, αυτές οιαναπαραγωγικές στρατηγικές εκτείνονται από την εναλλαγή του φυλετικού καιτου αφυλετικού τρόπου κατά τον κύκλο ζωής του οργανισμού έως την αυστηρήκλωνική αναπαραγωγή κατά την οποία δε συμβαίνει ανασυνδυασμός.Η αφυλετική αναπαραγωγή πιστεύεται ότι είναι σπάνια στο ζωικόβασίλειο. Γενικά, οι αφυλετικοί οργανισμοί θεωρούνται εξελικτικά αδιέξοδαγιατί έρχονται αντιμέτωποι με σημαντικά μειονεκτήματα, τόσο άμεσα όσο καιέμμεσα, που απειλούν την εξελικτική τους συνέχεια. Ωστόσο, διάφοροιγενετικοί παράγοντες που σχετίζονται με την αφυλετική αναπαραγωγή, όπως γιαπαράδειγμα η πολυπλοειδία, μπορούν πιθανόν να ανανεώσουν τη γονιδιακήδεξαμενή των κλωνικών στελεχών, συμβάλλοντας θετικά στην προσαρμογή τους.Στην παρούσα εργασία, η Artemia χρησιμοποιήθηκε ως οργανισμός-μοντέλο για τον έλεγχο των βαθμών πλοειδίας, τη σύσταση τωνπαρθενογενετικών πληθυσμών καθώς και τη προέλευση και το βαθμό τηςκλωνικής ποικιλότητας των παρθενογενετικών στελεχών. Επιπλέον, έγινεπροσδιορισμός του φαινομένου της παρθενογένεσης και της πολυπλοειδίαςμέσα στο γένος, λαμβάνοντας υπόψη τις φυλογενετικές σχέσεις και ταγεωγραφικά πρότυπα των παρθενογενετικών πληθυσμών και των συγγενικώντους αμφιγονικών ειδών.Το γένος Artemia περιλαμβάνει οργανισμούς που ανήκουν στακαρκινοειδή και ειδικότερα στην τάξη των ανοστράκων, οι οποίοι έχουνπαγκόσμια εξάπλωση (εκτός της Ανταρκτικής), και είναι ευρύτερα γνωστοί ως«γαρίδες της άλμης». Μέχρι τον προηγούμενο αιώνα, οι περισσότερες μελέτεςπου είχαν γίνει αφορούσαν τη βιολογία και την οικολογία της Artemia. Αν καιείναι περισσότερο γνωστή για τη χρήση της ως ζωντανή τροφή για θαλάσσιουςοργανισμούς και οργανισμούς του γλυκού νερού, από εξελικτικής άποψης,αυτό το είδος είναι εξίσου συναρπαστικό. Δύο διαφορετικοί τρόποιαναπαραγωγής μπορούν να ανιχνευτούν: η φυλετική αναπαραγωγή και ηπαρθενογένεση. Πιο αναλυτικά, το γένος Artemia περιλαμβάνει έξι καλάχαρακτηρισμένα αμφιγονικά είδη και έναν μεγάλο αριθμό παρθενογενετικών στελεχών, τα οποία εμφανίζουν διαφορετικούς βαθμούς πλοειδίας (2n – 5n).Όσον αφορά τα παρθενογενετικά στελέχη, τα πολυπλοειδή θεωρούνταιαπομικτικά σε αντίθεση με τα αυτομικτικά διπλοειδή στελέχη. Επίσης, όλα ταάτομα Artemia, ανεξάρτητα από τον τρόπο αναπαραγωγής τους, μπορούν ναπαράγουν ναυπλίους (ωοζωοτοκία) ή εγκυστομένα διαπαυσιακά έμβρυα, τιςκύστεις (ωοτοκία). Η απελευθέρωση των ναυπλίων επιτρέπει τη ταχεία ανάπτυξητου πληθυσμού όταν οι συνθήκες το επιτρέπουν, ενώ, όταν πάψουν να είναιευνοϊκές, η ωοτοκία εξασφαλίζει την επιβίωση του πληθυσμού. Επιπλέον, οικύστεις μπορούν να μεταφερθούν μέσω των ζωικών οργανισμών, του ανέμου ήτου ανθρώπου, επιτρέποντας την εξάπλωση του οργανισμού σε άλλαενδιαιτήματα (παθητική μεταφορά). Τέλος, η συσσώρευση των κύστεων στονπυθμένα των υδατοσυλλογών έχει ως αποτέλεσμα τη δημιουργία «τραπεζών» μεδιαπαυσιακές μορφές. Προηγούμενες μελέτες, που είχαν εστιάσει στιςφυλογενετικές σχέσεις μέσα στο γένος Artemia, αποκάλυψαν ότι τα τρίαασιατικά αμφιγονικά είδη εμπλέκονται στην εμφάνιση της παρθενογένεσης.Ωστόσο, δεν υπάρχουν δεδομένα που να αποκαλύπτουν το μηχανισμό πουοδήγησε στην εγκατάλειψη/απώλεια του φυλετικού τρόπου αναπαραγωγής ήστα πρότυπα που περιγράφουν την κατανομή τους. Στην παρούσα εργασία, ηεφαρμογή για πρώτη φορά της κυτταρομετρίας ροής με τουςμικροδορυφορικούς δείκτες, καθώς ο συνδυασμός τους με την ανάλυση ενόςτμήματος του μιτοχονδριακού DNA, προσέφερε νέες πληροφορίες σχετικά με τοφαινόμενο της παρθενογένεσης στο γένος Artemia.Η σχετική ποσότητα του DNA υπολογίστηκε με την κυτταρομετρία ροής.Συνολικά ελέγχθηκαν 29 πληθυσμοί (23 παρθενογενετικοί και 6 αμφιγονικοί),που κατανέμονται παγκοσμίως, μετρώντας τη μέση ένταση του φθορισμού κάθεάγνωστου δείγματος με το μέσο όρο της έντασης που μετρήθηκε στουςπληθυσμούς που είναι χαρακτηρισμένοι κυτταρογενετικά.Ο γενετικός χαρακτηρισμός των παρθενογενετικών πληθυσμών (23πληθυσμοί, 475 δείγματα) βασίστηκε στην ανάλυση πέντε μικροδορυφορικώντόπων. Από τα αποτελέσματα της γενοτύπησης υπολογίστηκαν οι συχνότητεςτων αλληλομόρφων και οι δείκτες κλωνικής ποικιλομορφίας (δείκτες Simpsonκαι Shannon, δείκτης ομοιομορφίας). Για την εξέταση και το χαρακτηρισμό τηςτάσης ομαδοποίησης των παρατηρούμενων κλώνων, εφαρμόστηκε η ανάλυσηκύριων συνιστωσών (PCA), με την οποία μειώνεται η πολυπλοκότητα τωνδεδομένων, καθώς και η ομαδοποίηση Κ-μέσων για την εξαγωγήσυμπερασμάτων σχετικά με τη γενετική δομή των πληθυσμών. Επιπλέον, υπολογίστηκαν οι γενετικές αποστάσεις: α) μεταξύ των ατόμων, ώστε ναυπολογιστούν και να συγκριθούν οι μέσες γενετικές αποστάσεις εντός καιμεταξύ των ομάδων που συγκροτούν τα άτομα της ίδιας πλοειδίας, και β)μεταξύ των πληθυσμών, για την κατασκευή φυλογενετικών δέντρων. Τέλος,ελέγχθηκε η συσχέτιση σε πληθυσμιακό επίπεδο των γενετικών αποστάσεων μετις γεωγραφικές αποστάσεις εφαρμόζοντας τη δοκιμασία Mantel.Ένα τμήμα του μιτοχονδριακού γονιδίου για την υπομονάδα Ι τηςκυτοχρωμικής οξειδάσης αλληλουχήθηκε ώστε: α) να υπολογιστεί η γενετικήποικιλομορφία μεταξύ των πληθυσμών με βάση τις ακολουθίες που βρέθηκανσε αυτούς, β) να συγκριθούν οι γενετικές αποστάσεις εντός και μεταξύ τωνομάδων που συγκροτούν τα άτομα της ίδιας πλοειδίας, και γ) για ναεπιβεβαιωθεί η μητρική προέλευση των ατόμων. Επίσης, ο δείκτης αυτόςχρησιμοποιήθηκε και για τη μελέτη των φυλογενετικών σχέσεων μέσα στο γένοςArtemia εφαρμόζοντας διαφορετικές μεθόδους (MP – μέγιστη φειδωλότητα, ML– μέγιστη πιθανοφάνεια, BI – ανάλυση κατά Bayes).Όλα τα αμφιγονικά είδη εμφάνισαν μία κορυφή στα ιστογράμματακατανομής συχνοτήτων, ενώ ο αριθμός των κορυφών του εκάστοτεπαρθενογενετικού πληθυσμού κυμάνθηκε από 1 έως 3. Ειδικότερα, 9 από τους23 πληθυσμούς βρέθηκαν να είναι μικτοί. Συνολικά ανιχνεύτηκαν 164σύνθετοι γενότυποι οι οποίοι εντάχθηκαν σε 31 κλώνους. Οι περισσότεροικλώνοι ήταν διπλοειδείς (20/31) ενώ 2 και 9 κλώνοι, αντίστοιχα, ήταντριπλοειδείς και τετραπλοειδείς. Η μεγαλύτερη κλωνική ποικιλότηταπαρατηρήθηκε σε εκείνους τους πληθυσμούς που αποτελούνταν κατά κύριολόγο ή αποκλειστικά από διπλοειδείς κλώνους, με εξαίρεση τον πληθυσμό τουΜεγάλου Εμβόλου (Ελλάδα) στον οποίο βρέθηκαν κλώνοι και των τριώνπλοειδιών. Ο δείκτης της ομοιομορφίας έλαβε τιμές κοντά στο πάνω άκρο τηςκατανομής του, υποδεικνύοντας ότι η κατανομή των κλώνων είναι αρκετάομοιόμορφη. Οι γενετικές αποστάσεις εντός και μεταξύ των ομάδων πουσυγκροτούν τα άτομα της ίδιας πλοειδίας, καθώς και η PCA, έδειξαν ότι: α) τατριπλοειδή και τα τετραπλοειδή στελέχη συγκροτούν διακριτές (62,2%) καιαρκετά συμπυκνωμένες (57,3% και 26,3% μέση γενετική απόσταση,αντίστοιχα) ομάδες, ενδεικτικό της χαμηλής γενετικής τους ποικιλότητας, και β)οι διπλοεδείς κλώνοι είναι πολύ διασκοπρισμένοι (77,9% μέση γενετικήαπόσταση μεταξύ τους), προτείνοντας ότι περιέχουν ένα σημαντικό ποσοστόγενετικής ποικιλομορφίας, και σχεδόν ισαπέχουν από τις άλλες δύο ομάδεςπολυπλοειδών στελεχών (46,1% από τα τριπλοειδή και 42,2% από τα τετραπλοειδή). Η χρήση της μεθόδου της ομαδοποίησης Κ-μέσων επέτρεψε τηνταξινόμηση των παρθενογενετικών ατόμων σε πέντε ομάδες (Κ1 – Κ5). Πιοαναλυτικά, η ομάδα Κ1, η οποία αποτελείται από διπλοειδή και τετραπλοειδήστελέχη, συναντάται κατά μήκος της κατανομής που καλύπτει ηδειγματοληψία, με εξαίρεση το νότιο τμήμα του Παλαιού Κόσμου και το βόρειοτμήμα της Ανατολικής λεκάνης της Μεσογείου. Σε αυτές τις περιοχέςσυναντάται ως επί το πλείστο ή αποκλειστικά η ομάδα Κ3, η οποία αποτελείταιαπό τριπλοειδή στελέχη. Οι άλλες τρεις ομάδες (Κ2 = τετραπλοειδή, Κ4 =διπλοειδή, Κ5 = τετραπλοειδή) κατανέμονται μόνο στην Ανατολική λεκάνης τηςΜεσογείου. Συνολικά, υπάρχει σημαντική συσχέτιση μεταξύ των γενετικών καιτων γεωγραφικών αποστάσεων (r = 0,325, p = 0,006).Το σύνολο δεδομένων του μιτοχονδριακού δείκτη περιείχε 50ακολουθίες από παρθενογενετικά άτομα, 9 από αντιπροσώπους όλων τωναμφιγονικών ειδών Artemia και μια ακολουθία του οργανισμούStreptocephalus dorothae (60 ακολουθίες συνολικά). Αυτές οι ακολουθίεςέδωσαν 22 απλοτύπους εκ των οποίων 13 ανήκαν σε παρθενογενετικά άτομα (6σε διπλοειδή, 5 σε τριπλοειδή, και 2 σε τετραπλοειδή). Οι περισσότεροιπαρθενογενετικοί απλότυποι βρέθηκαν μόνο σε ένα συγκεκριμένο πληθυσμόκαι μόνο 4 από αυτούς βρέθηκαν σε περισσότερους από δύο πληθυσμούς. Τομεγαλύτερο ποσοστό ποικιλομορφίας παρατηρήθηκε μεταξύ των διπλοειδών καιακολούθησαν οι τριπλοειδείς, ενώ η γενετική απόσταση μεταξύ τωντετραπλοειδών ήταν σχεδόν μηδενική. Οι συγκρίσεις μεταξύ των ομάδων έδειξανότι τα τριπλοειδή είναι πολύ κοντά στα διπλοειδή (1,5%), ενώ η απόσταση τωνδύο αυτών ομάδων από τα τετραπλοειδή είναι σχεδόν ίση (26,1% από ταδιπλοειδή και 25,7% από τα τριπλοειδή). Όλα τα δέντρα που κατασκευάστηκαν(MP, ML, BI) αποκάλυψαν την ίδια βασική τοπολογία. Η A. persimilis είναι τοπιο αρχέγονο είδος και ακολουθούν τα είδη A. salina και A. franciscana. Ταάλλα τρία αμφιγονικά είδη μαζί με τα παρθενογενετικά στελέχη συγκροτούντέσσερις ομάδες: η πρώτη αποτελείται από το αμφιγονικό είδος A. sinica καιόλα τα τετραπλοειδή στελέχη, η δεύτερη από το είδος A. urmiana και 3παρθενογενετικούς απλοτύπους, ενώ τα υπόλοιπα διπλοειδή και τριπλοειδήπαρθενογενετικά στελέχη συνθέτουν την τρίτη ομάδα. Τέλος, η τέταρτη ομάδαπεριέχει μόνο απλοτύπους που ανήκουν στο είδος A. tibetiana.Η παρούσα διατριβή αντιπροσωπεύει μια λεπτομερή διερεύνηση τηςπληθυσμιακής δομής και της ποικιλότητας των αφυλετικά αναπαραγόμενωνστελεχών του γένους Artemia. Ο συνδυασμός της κυτταρομετρίας ροής, η γενοτύπηση των μικροδορυφορικών δεικτών και η αλληλούχιση τουμιτοχονδριακού δείκτη, προσέφερε στοιχεία για τη γενετική σύσταση τωνπαρθενογενετικών πληθυσμών αυτού του ασπόνδυλου οργανισμού. Ηκυτταρομετρία ροής και η ανάλυση των μικροδορυφορικών δεικτών απέδειξανότι οι παρθενογενετικοί πληθυσμοί μπορεί να αποτελούνται από στελέχηδιαφορετικής πλοειδίας (2n – 4n) και ότι μπορεί να είναι μονοκλωνικοί ήπολυκλωνικοί. Στη δεύτερη περίπτωση οι κλώνοι μπορεί να είναι της ίδιας ήδιαφορετικής πλοειδίας.Με βάση τη δειγματοληψία, τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίαςυποστηρίζουν ότι: α) η πολυπλοειδία εμφανίστηκε περισσότερες από μία φορέςστο γένος Artemia, με τα τριπλοειδή και τα τετραπλοειδή να έχουν ανεξάρτητηπροέλευση από διαφορετικά άτομα, και β) τα διπλοειδή παρθενογενετικάστελέχη εμφανίστηκαν δύο φορές. Ειδικότερα, τα τριπλοειδή φαίνεται να έχουνπροκύψει από έναν διπλοειδή παρθενογενετικό πρόγονο και μοιράζονται,επίσης, έναν κοινό πρόγονο με το είδος A. urmiana, ενώ τα τετραπλοειδήστελέχη μοιράζονται κοινό πρόγονο με το είδος A. sinica. Επιπλέον, ταδιπλοειδή συγκροτούν δύο εξελικτικές γραμμές, ενδεικτικό της πολυφυλετικήςτους προέλευσης.Όσον αφορά την προέλευση της παρθενογένεσης, η παρούσα εργασίαπροσφέρει στοιχεία που υποστηρίζουν ότι η Artemia δεν αποτελεί ξενιστή τηςWolbachia. Ο έλεγχος τόσο παρθενογενετικά όσο και αμφιγονικάαναπαραγόμενων ατόμων δεν αποκάλυψε μόλυνση με το βακτήριο (δενενισχύθηκε τμήμα του γονιδίου της μεγάλης ριβοσωμικής υπομονάδας τουβακτηρίου με ειδικούς για αυτό εκκινητές). Για αυτό, η πιθανότητα να έχει ηπαρθενογένεση στην Artemia μολυσματική προέλευση είναι απειροελάχιστη.Αντίθετα, η υβριδική (πρωτογενώς) και η μεταδοτική (δευτερογενώς) προέλευσηείναι οι πιο πιθανοί μηχανισμοί που οδήγησαν στην εγκατάλειψη/στο χάσιμοτης φυλετικής αναπαραγωγής και στην εμφάνιση της πολυπλοειδίας. Ωστόσο, ομηχανισμός της αυτόματης προέλευσης δεν μπορεί να απορριφθεί.Η παρατηρούμενη κατανομή των παρθενογενετικών στελεχών και τωναμφιγονικών ειδών, εξηγείται καλύτερα με το φαινόμενο της γεωγραφικήςπαρθενογένεσης, αφού οι διπλοειδείς κλώνοι εμφανίζουν την ευρύτερηκατανομή. Ωστόσο, κάθε διπλοειδής κλώνος, υποστηρίζοντας την υπόθεση του«γενοτύπου στενής οικοθέσης», βρέθηκε περιορισμένος σε έναν πληθυσμό, ενώκάθε τριπλοειδής και αρκετοί από τους τετραπλοειδείς κλώνους, υποστηρίζουντην υπόθεση του «γενοτύπου ευρείας οικοθέσης», αφού βρέθηκαν σε περισσότερους από έναν πληθυσμούς. Η παρατηρούμενη κατανομή τωναφυλετικά αναπαραγόμενων στελεχών είναι πιθανώς αποτέλεσμα πολλώνπαραγόντων. Το σύνολο των διπλοειδών και των τριπλοειδών στελεχών φαίνεταινα έχουν διαφορετικό κέντρο προέλευσης από τα τετραπλοειδή στελέχη, όπωςπροκύπτει από την μη επικαλυπτόμενη κατανομή των στενά συγγενικώναμφιγονικών ειδών τους. Ωστόσο κυτταρολογικοί (αυτόμιξη – απόμιξη),οικολογικοί (π.χ. αλατότητα, θερμοκρασία), δημογραφικοί (π.χ. «κατειλημμένα»ή «κενά» ενδιαιτήματα), και ιστορικοί παράγοντες έχουν συμβάλει στηδιαμόρφωση της παρατηρούμενης εικόνας.
