Διερεύνηση του ρόλου της φυσικής ανοσίας στην παθογένεια λοιμώξεων με εντεροΐούς

This item is provided by the institution :

Repository :
National Archive of PhD Theses
see the original item page
in the repository's web site and access all digital files if the item*

PhD thesis (EN)

2011 (EN)
Exploring the role of innate immunity in pathogenesis of enterovirus infections
Διερεύνηση του ρόλου της φυσικής ανοσίας στην παθογένεια λοιμώξεων με εντεροΐούς

Μαυρούλη, Μαρία

More than 90% of coxsackievirus infections progress subclinically and theyrarely cause life-threatening illness. Coxsackieviruses A are responsible for mild upperrespiratory illness, while coxsackieviruses Β have been associated with severe or evenlethal diseases, including acute myocarditis and acute aseptic meningitis, as well aschronic diseases such as dilated cardiomyopathy. It is generally accepted that specificcoxsackievirus serotypes can cause specific clinical disorders. CVB3 is involved in63% of myocarditis cases and may lead to dilated cardiomyopathy, whereas CVB4 hasbeen implicated in the pathogenesis of insulin-dependent diabetes mellitus.Toll-like receptors are transmembrane proteins structurally related to the Tollreceptor of Drosophila. They are innate immunity sensors which recognize conservedpathogen-associated molecular patterns, endogenous cellular ligands and syntheticcomponents. They consist of an extracellular domain that recognize the ligands and anintracellular domain that contributes to the activation of signaling pathways. Tendifferent human TLRs have been identified.Single nucleotide polymorphisms (SNPs) result from point mutations. The Tlr4gene has two non-synonymous polymorphisms at amino acid locations Asp299Gly andThr399Ile of the extacellular domain of TLR4 due to the substitution of aspartic acidfrom glycine and the substitution of threonine from isoleukine, respectively.Asp299Gly and Thr399Ile are found at a frequency of 1-10% in the generalpopulation. It is shown that the increased TLR4 production is associated withenterovirus replication and high viral RNA and TLR4 mRNA levels are correlatedwith the development of viral myocarditis and dilated cardiomyopathy. Also, it isdemonstrated that CVB3 infection leads to an increase of TLR4 expression inmacrophages, which are activated to produce proinflammatory cytokines inmyocardium, while CVB4 triggers the production of cytokines in human pancreaticcells through a TLR4-dependent pathway.According to the above studies, it is implied that the TLR4 dysfunction couldbe a predisposing factor for the development enteroviral infections. These twopolymorphisms could affect the docking surface structure and reduce the interactionaffinity between the receptor and its ligand. In order to determine if the high frequencyof Coxsackievirus infections is related with the increased appearance of TLR4polymorphisms, we studied serologically the prevalence of Coxsackieviruses Bthroughout Greece.Traditionally, many clinical laboratories use the serum neutralization assay, alaborious procedure that requires the existence of “live” virus in cell culture, for thedetermination of Coxsackievirus. ELISA assay has been applied in serological diagnosis, but its value is limited due to the frequently observed cross-reactions amongantigens from different coxsackievirus serotypes and other enteroviruses. In order todevelop an immunosorbent assay with the ability to discriminate among differentcoxsackievirus serotypes, peptides which mimic a non-conserved amino-terminalepitope of the capsid protein VP1 of coxsackieviruses were synthesized. Thesepeptides were chosen because they include amino acid sequences that discriminatedifferent Coxsackie virus serotypes.The analysis of reactivity of serum samples from healthy blood donors againstthe three synthetic peptides indicated that the reactivities of positive samples detectedusing anti-peptide ELISAs can be easily discriminated from the ones observed withanti-CVB1/B5 ELISA. For the majority of sera, anti-CVB3pep and anti-CVB4pepreactivities were distinct and antigen specific. However, a group of sera exhibited highreactivity against both peptides, suggesting a correlation of CVB3pep and CVB4peprecognition. The comparison of the virus neutralization test and our ELISA assays datademonstrated that anti-CVB3pep and anti-CVB4pep activity were resided mainlyamong the sera possessing anti-CVB3 and anti-CVB4 neutralizing antibodies.Titration and evaluation of avidity of IgG antibodies against CVB4pep,CVB3pep and CVA24pep epitopes in polyreactive sera, evaluation of the specificity ofpeptide-antibody interactions with homologous and heterologous inhibition assays,affinity purification of specific anti-peptide antibodies and evaluation of theirspecificity were carried out. From the above experiments, it was concluded that themajority of sera possess antibodies that recognize one of CVB3pep, CVB4pep orCVA24pep peptides with antigen specific way. However, some sera seem to possessan antibody subpopulation which is reactive with all three peptides. In this case, anti-CVA24 IgG antibodies recognize only the CVA24pep. Anti-CVB4 and -CVB3 IgGantibodies are either antigen specific (homotypic antibodies) or recognize bothpeptides (heterotypic antibodies) but with different avidity. It is possible that the anti-CVB3 is the initial specificity of homotypic antibodies, whereas the anti-CVB4reactivity occurs as a result of cross-reactions with conserved structures on CVB4pep.The assay was applied to a large number of blood donors from six differentblood donation sites of Greece. Antibodies against CVB4 were detected to a greaterextent in Athens and antibodies against CVB1/B5 in Iraklio/Crete. Taking into accountthat TLR4 is implicated in the detection of enterovirus replication, it was examinedwhether Asp299Gly and Thr399Ile SNPs in TLR4 are associated with the occurrenceof enterovirus-induced meningoencephalitis. The study group consists of samples frompediatric patients with enterovirus-induced meningoencephalitis while the controlgroup comprises of samples from 40 healthy blood donors. Genomic DNA wasisolated from CSF and blood samples and specific TaqMan PCR was applied. The majority of samples come from people who are homozygous for the wildtype allele. This allele represents the normal situation, where no polymorphism isobserved at amino acid locations Asp299Gly and Thr399Ile of the extacellular domainof TLR4 receptor. From the 40 healthy individuals, only one blood donor displays highfluorescence for the stimulated fluorophore ΤΕΤ and bears both SNPs in heterozygousstate in 2,3%. Two of the 44 pediatric patients with enteroviral meningitis possess bothpolymorphisms in heterozygous state, as it was confirmed from DNA sequencingexperiments. The samples which have Asp299Gly polymorphism, they, also, come upwith Thr399Ile polymorphism due to the linkage disequilibrium which is observed inthe European population.Despite the higher frequency of polymorphisms observed in pediatric patientswith enteroviral meningitis compared to the frequency of polymorphisms in healthyblood donors, the TLR4 polymorphisms are not correlated, at a statistically significantlevel, to the appearance of enterovirus-induced meningoencephalitis, at least for thatnumber of samples.
Περισσότερο από το 90% των λοιμώξεων που προκαλούνται από ιούςCoxsackie εμφανίζουν υποκλινική διαδρομή και σπάνια προκαλούν απειλητική για τηζωή νόσο. Οι ιοί Coxsackie Α προκαλούν ήπιες λοιμώξεις του αναπνευστικούσυστήματος, ενώ οι ιοί Coxsackie Β σχετίζονται με σοβαρότερες ή ακόμα καιθανατηφόρες νόσους, όπως η οξεία μυοκαρδίτιδα και η οξεία άσηπτη μηνιγγίτιδα,καθώς και με χρόνιες νόσους, όπως η διατατική καρδιομυοπάθεια. Συγκεκριμένοιορότυποι των ιών Coxsackie μπορούν να προκαλέσουν συγκεκριμένες κλινικέςδιαταραχές. Έτσι, o ιός Coxsackie B3 εμπλέκεται στο 63% των περιπτώσεωνμυοκαρδίτιδας και μπορεί να οδηγήσει στην εμφάνιση διατατικής μυοκαρδιοπάθειαςενώ ο ιός Coxsackie B4 ενοχοποιείται ότι ενέχεται στην παθογένεση του διαβήτητύπου Ι.Οι Toll-like υποδοχείς είναι διαμεμβρανικές πρωτεΐνες δομικά ομόλογες με τονToll υποδοχέα της Drosophila. Αποτελούν αισθητήρες της φυσικής ανοσίας πουαναγνωρίζουν συντηρημένα μοριακά πρότυπα παθογόνων μικροοργανισμών, ενδογενήκυτταρικά στοιχεία και συνθετικές ουσίες. Διαθέτουν μια εξωκυττάρια περιοχή, πουεμπλέκεται στην αναγνώριση του παθογόνου παράγοντα, και μια κυτταροπλασματικήπεριοχή, μέσω της οποίας γίνεται ενεργοποίηση οδών μεταγωγής μηνυμάτων. Στονάνθρωπο έχουν αναγνωριστεί 10 TLRs.Οι πολυμορφισμοί ενός νουκλεοτιδίου (single nucleotide polymorphisms,SNPs) προκύπτουν κατά την αντικατάσταση ενός νουκλεοτιδίου από ένα άλλο. Στογονίδιο του TLR4 έχουν ταυτοποιηθεί δυο μη συνώνυμοι πολυμορφισμοί πουαντιστοιχούν στη θέση 299 και 399 της εξωκυττάριας περιοχής του TLR4. ΟAsp299Gly προκύπτει κατά την αντικατάσταση του ασπαρτικού οξέος από γλυκίνη καιο Thr399Ile από την αντικατάσταση θρεονίνης από ισολευκίνη. Οι πολυμορφισμοίAsp299Gly και Thr399Ile του TLR4 απαντώνται με συχνότητα εμφάνισης 1-10% στογενικό πληθυσμό. Έχει δειχθεί ότι η αυξημένη έκφραση του TLR4 σχετίζεται με τονπολλαπλασιασμό των εντεροϊών και τα υψηλά επίπεδα RNA τόσο των ιών όσο και τουTLR4 σχετίζονται με την εμφάνιση ιογενούς μυοκαρδίτιδας και διατατικήςμυοκαρδιοπάθειας. Ακόμη, έχει διαπιστωθεί ότι η λοίμωξη με ιό Coxsackie B3 οδηγείσε αύξηση της έκφρασης του TLR4 στα μακροφάγα, η οποία ενεργοποιεί τα κύτταρααυτά έτσι ώστε να παράγουν προφλεγμονώδεις κυτταροκίνες στον καρδιακό οστό,ενώ η Coxsackie B4 επαγώμενη παραγωγή κυτταροκινών σε παγκρεατικά κύτταραπραγματοποιείται με τη μεσολάβηση του TLR4.Σύμφωνα με τις παραπάνω μελέτες προκύπτει ότι η δυσλειτουργία του TLR4 θαμπορούσε να αποτελέσει προδιαθεσικό παράγοντα για την εμφάνιση λοιμώξεων πουπροκαλούνται από εντεροϊούς. Οι δυο πολυμορφισμοί μπορούν να προκαλέσουν διαταραχή της δομής που συνιστά την επιφάνεια επαφής με πιθανή συνέπεια τημειωμένη συγγένεια αλληλεπίδρασης του υποδοχέα με τον συνδέτη. Προκειμένου ναδιαπιστώσουμε αν η αυξημένη συχνότητα λοιμώξεων από ιούς Coxsackie συσχετίζεταιμε αυξημένη εμφάνιση πολυμορφισμών στους Toll-like υποδοχείς, χρειάστηκε ναπροσδιοριστεί ο επιπολασμός των ιών Coxsackie στην Ελληνική Επικράτεια.Παραδοσιακά, πολλά κλινικά εργαστήρια χρησιμοποιούν τη μέθοδο τηςοροεξουδετέρωσης, μια επίπονη διαδικασία που απαιτεί την ύπαρξη του ενεργού ιούσε καλλιέργεια, για τον προσδιορισμό του οροτύπου των ιών Coxsackie σε διάφορακλινικά δείγματα. Η τεχνική ELISA έχει εφαρμοστεί στην ορολογική διάγνωση, αλλάη χρήση της περιορίζεται λόγω των συχνών διασταυρούμενων αντιδράσεων μεαντιγόνα που προέρχονται από άλλους εντεροϊούς. Προκειμένου να αναπτύξουμεανοσοενζυμική τεχνική στερεάς φάσης με δυνατότητα διάκρισης αντισωμάτων έναντιδιαφορετικών οροτύπων των ιών Coxsackie, σχεδιάστηκαν και παρασκευάστηκανσυνθετικά πεπτίδια που μιμούνται ένα μη συντηρημένο επίτοπο της αμινοτελικήςπεριοχής της καψιδικής πρωτεΐνης VP1 των ιών Coxsackie, ο οποίος έχει επιλεχθείγιατί περικλείει αλληλουχίες που διαφοροποιούν τους οροτύπους των ιών Coxsackie.Η μελέτη της δραστικότητας των ορών υγιών αιμοδοτών έναντι των τριώνπεπτιδίων έδειξε ότι οι δραστικότητες που προκύπτουν από τις αντι-πεπτιδικές ELISAείναι αντιγονικά διακριτές από αυτές που παρατηρούνται κατά την εμπορική αντι-CVB1/B5 ELISA. Ξεκάθαρη διάκριση υπήρξε ανάμεσα στις δραστικότητες αντι-Coxsackie A24 και αντι-Β3 ή αντι-Β4. Για την πλειονότητα των ορών, οι αντι-Β3 καιαντι-Β4 δραστικότητες ήταν ξεχωριστές. Όμως για μια υπομονάδα ορών, οιδραστικότητες αυτές βρέθηκαν να σχετίζονται στατιστικά σημαντικά. Η σύγκριση τηςαντιπεπτιδικής δραστικότητας με την ειδικότητα προσδιορισμού εξουδετερωτικώναντισωμάτων έδειξε ότι η αντι-CVB3pep και αντι-CVB4 δραστικότητα παρατηρείταικυρίως μεταξύ των ορών που φέρουν εξουδετερωτικά αντισώματα έναντι των ιώνCVΒ3 και CVB4Πραγματοποιήθηκε, ακόμη, τιτλοποίηση και εκτίμηση της συνάφειας τωναντιπεπτιδικών IgG αντισωμάτων σε ορούς με υψηλή δραστικότητα έναντι των τριώνπεπτιδίων, έλεγχος της ειδικότητας αναγνώρισης των πεπτιδίων με πειράματαομόλογης και ετερόλογης αναστολής, καθαρισμός ειδικών αντιπεπτιδικώναντισωμάτων με χρωματογραφία ανοσοσυγγένειας και εκτίμηση της δραστικότηταςτων κεκαθαρμένων αντισωμάτων έναντι των τριών πεπτιδίων οδήγησαν στα παρακάτωσυμπεράσματα. Από τα παραπάνω πειράματα διαπιστώθηκε ότι η πλειονότητα τωνορών διαθέτει αντισώματα που αναγνωρίζουν ένα από τα πεπτίδια CVB3pep,CVB4pep ή CVA24pep με αντιγονοειδικό τρόπο. Ωστόσο, υπάρχουν ορισμένοι οροίπου διαθέτουν αντισώματα τα οποία αναγνωρίζουν και τα τρία πεπτίδια. Στηνπερίπτωση αυτή, τα αντι-CVA24 IgG αντισώματα αναγνωρίζουν μόνο το CVA24pep.Τα αντι-CVB4 και αντι-CVB3 IgG αντισώματα είτε αναγνωρίζουν αποκλειστικά το αντιγόνο-στόχο τους (ομοτυπικά αντισώματα) είτε αναγνωρίζουν και τα δύο πεπτίδια(ετεροτυπικά αντισώματα) αλλά με διαφορετική συνάφεια. Πιθανώς η αντι-CVB3είναι η αρχική δραστικότητα των ομοτυπικών αντισωμάτων, ενώ η αντι-CVB4δραστικότητα των ιδίων αντισωμάτων φαίνεται να είναι αποτέλεσμα διασταυρούμενηςαντίδρασης με συντηρημένες περιοχές στο ομόλογο CVB4pep.Η τεχνική που αναπτύξαμε εφαρμόστηκε σε μεγάλο αριθμό αιμοδοτών από έξικέντρα αιμοδοσίας της Ελλάδας, όμως δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντικήπροτίμηση του ιού για συγκεκριμένη γεωγραφική περιοχή εκτός της Αθήνας για τουςCoxsackie B4 και της Κρήτης για τους Coxsackie B1/B5. Προχωρήσαμε στη μελέτητης ύπαρξης των δύο πολυμορφισμών του TLR4 και τη διερεύνηση της συσχέτισηςτων δύο αυτών πολυμορφισμών του TLR4 με την εμφάνιση λοιμώξεων από εντεροϊούςκαι ιδιαίτερα με την εμφάνιση μηνιγγίτιδας. Ως ομάδα μελέτης χρησιμοποιήσαμεδείγματα από παιδιατρικές κλινικές ασθενών με ιογενή μηνιγγίτιδα από εντεροϊούςενώ ως ομάδα ελέγχου δείγματα από 40 υγιείς αιμοδότες. Ακολούθησε απομόνωσηγενετικού υλικού και εφαρμογή αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης πραγματικούχρόνου με τη μέθοδο TaqMan.Η πλειοψηφία των δειγμάτων που μελετήθηκαν προέρχεται από άτομα που είναιομόζυγα για το αλληλόμορφο αγρίου τύπου που αντιπροσωπεύει τη φυσιολογικήκατάσταση κατά την οποία δεν παρατηρείται πολυμορφισμός στις θέσεις 299 και 399της εξωκυττάριας περιοχής του TLR4 υποδοχέα. Μόνο ένας αιμοδότης παρουσιάζειέντονο φθορισμό για το διεγερμένο φθορόχρωμα ΤΕΤ και φέρει και τους δυοπολυμορφισμούς σε ετερόζυγη κατάσταση σε ποσοστό 2,5%. Δύο από τους 44παιδιατρικούς ασθενείς με μηνιγγίτιδα από εντεροϊούς φέρουν και τους δύοπολυμορφισμούς σε ετερόζυγη μορφή, όπως επιβεβαιώθηκε και από τα αποτελέσματατου προσδιορισμού της αλληλουχίας των τμημάτων DNA που είναι πιθανό να φέρουντους πολυμορφισμούς. Τα δείγματα που φέρουν τον πολυμορφισμό Asp299Gly φέρουνεπίσης τον πολυμορφισμό Thr399Ile του TLR4 λόγω της ανισορροπίας διασύνδεσηςπου παρατηρείται στον Ευρωπαϊκό πληθυσμό (Καυκάσιοι).Παρότι παρατηρείται αυξημένη συχνότητα εμφάνισης των πολυμορφισμώνστους παιδιατρικούς ασθενείς με μηνιγγίτιδα από εντεροϊούς σε σύγκριση με τησυχνότητα εμφάνισης των πολυμορφισμών σε υγιείς αιμοδότες, δεν φαίνεται,τουλάχιστον για το συγκεκριμένο αριθμό δειγμάτων, να φτάνει σε στατιστικάσημαντικό επίπεδο η συσχέτιση της ύπαρξης των δύο πολυμορφισμών του TLR4 μετην εμφάνιση μηνιγγοεγκεφαλίτιδας από εντεροϊούς.

Coxsackie viruses
Ιός Coxsackie

Εθνικό Κέντρο Τεκμηρίωσης (ΕΚΤ) (EL)
National Documentation Centre (EKT) (EN)



National and Kapodistrian University of Athens
Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών (ΕΚΠΑ)

*Institutions are responsible for keeping their URLs functional (digital file, item page in repository site)