Study of breast cancer cell in vitro with biochemical and immunohistochemical methods: in vitro study of the role of integrin alphavbeta3 in the pathogenesis of breast cancer

 
This item is provided by the institution :

Repository :
National Archive of PhD Theses
see the original item page
in the repository's web site and access all digital files if the item*
share



PhD thesis (EN)

2011 (EN)
Μελέτη καρκινικών κυττάρων μαστού in vitro με βιοχημικές και ανοσοϊστοχημικές μεθόδους: in vitro μελέτη του ρόλου της ιντεργκρίνης ανβ3 στην παθογένεια του καρκίνου του μαστού
Study of breast cancer cell in vitro with biochemical and immunohistochemical methods: in vitro study of the role of integrin alphavbeta3 in the pathogenesis of breast cancer

Georgoulis, Anastasios
Γεωργούλης, Αναστάσιος

Ο καρκίνος του μαστού αποτελεί τη συχνότερη κακοήθεια του γυναικείου πληθυσμού παγκοσμίως. Η κυριότερη αιτία θανάτου των ασθενών με καρκίνο του μαστού είναι η ανάπτυξη απομακρυσμένων μεταστάσεων σε θέσεις όπως τα οστά, οι πνεύμονες, το ήπαρ και ο εγκέφαλος. Η μετάσταση είναι μια πολυσταδιακή διαδικασία, κατά την οποία τα καρκινικά κύτταρα διηθούν τον περιβάλλοντα συνδετικό ιστό, εισέρχονται στη κυκλοφορία και κατόπιν εξαγγειώνονται και πολλαπλασιάζονται στη νέα θέση.Στα περισσότερα στάδια της μεταστατικής διαδικασίας συμμετέχουν οι ιντεγκρίνες, μια οικογένεια διαμεμβρανικών υποδοχέων προσκόλλησης που συνδέουν τον κυτταροσκελετό με την ΕΘΟ ή/και γειτονικά κύτταρα μεταξύ τους. Οι ιντεγκρίνες συνιστούν μια οικογένεια που αποτελείται από τουλάχιστον 24 διαμεμβρανικά ετεροδιμερή, τα οποία σχηματίζονται από τη μη ομοιοπολική σύνδεση 18 α και 8 β υπομονάδων. Κάθε ετεροδιμερές ιντεγκρινών παρουσιάζει εξειδίκευση για τους συνδέτες του, σύμφωνα με την οποία οι ιντεγκρίνες ταξινομούνται σε 4 μεγάλες κατηγορίες: εκείνες που συνδέονται με το κολλαγόνο, τις ιντεγκρίνες που αναγνωρίζουν το τριπεπτίδιο RGD (-Arg-Gly-Asp-) στα συστατικά της ΕΘΟ, τις ιντεγκρίνες που συνδέονται με τη λαμινίνη και τέλος τις ιντεγκρίνες που εκφράζονται ειδικά στα λευκοκύτταρα. Μετά τη πρόσδεση στους συνδέτες, το κυτταροπλασματικό τμήμα της β ιντεγκρινικής υπομονάδας συνδέεται με δομικές και σηματοδοτικές κυτταροπλασματικές πρωτεΐνες και έχει ως αποτέλεσμα την ομαδοποίηση των ιντεγκρινών, την οργάνωση του κυτταροσκελετού και την έναρξη σηματοδοτικών μονοπατιών που είναι απαραίτητα για τη κυτταρική προσκόλληση, μετανάστευση, πολλαπλασιασμό, επιβίωση και διαφοροποίηση.Οι περιοχές της πλασματικής μεμβράνης που οι ιντεγκρίνες συνδέουν τον κυτταροσκελετό της ακτίνης με την ΕΘΟ λέγονται θέσεις εστιακής προσκόλλησης. Η κυτταρική μετανάστευση πραγματοποιείται μέσω του συνεχούς πολυμερισμού των ινιδίων ακτίνης στο πρόσθιο άκρο και της ελεγχόμενης αποδιοργάνωσης των θέσεων προσκόλλησης στο οπίσθιο άκρο των καρκινικών κυττάρων. Ένας συνδυασμός στοχευόμενης ενδοκυττάρωσης/ανακύκλωσης και πλευρικής διάχυσης στη πλασματική μεμβράνη οδηγούν τις ιντεγκρίνες στις νεοσχηματιζόμενες θέσεις εστιακής προσκόλλησης στο πρόσθιο άκρο των μεταναστευτικών κυττάρων. Πρόσφατες εργασίες απέδειξαν ότι η ενδοκυττάρωση των ιντεγκρινών από τη πλασματική μεμβράνη στα πρώιμα ενδοσώματα και η επακόλουθη ανακύκλωσή τους στην κυτταρική επιφάνεια ρυθμίζουν την κυτταρική μετανάστευση και διήθηση.Ειδικότερα, η ιντεγκρίνη ανβ3, γνωστή και ως υποδοχέας βιτρονεκτίνης, προσδένεται στα συστατικά της ΕΘΟ μέσω της αλληλουχίας RGD και έχει βρεθεί ότι εμπλέκεται στη παθοφυσιολογία και εξέλιξη αρκετών μεταστατικών όγκων όπως το μελάνωμα, το γλοίωμα, το καρκίνο των ωοθηκών, το καρκίνο του προστάτη και το καρκίνο του μαστού. Συγκεκριμένα στο καρκίνο του μαστού, η αυξημένη έκφραση της ενεργοποιημένης ιντεγκρίνης ανβ3, αλλά όχι της μη ενεργοποιημένης, συνδέεται με το πολύ επιθετικό μεταστατικό φαινότυπο και σηματοδοτεί την εκτεταμένη μετάσταση των καρκινικών κυττάρων.Το ερευνητικό ενδιαφέρον στράφηκε στην ανάπτυξη στρατηγικών μπλοκαρίσματος της ιντεγκρίνης ανβ3 προκειμένου να αντιμετωπιστεί ένας μεγάλος αριθμός ασθενειών. Έτσι λοιπόν, σε in vitro μελέτες χρησιμοποιήθηκαν ανταγωνιστές της ιντεγκρίνης ανβ3 που περιλαμβάνουν RGD πεπτίδια, μικρά μόρια ανταγωνιστές, πεπτιδομιμητικά μόρια, ντισιντεγκρίνες και μονοκλωνικά αντισώματα. Η αλληλουχία RGD αποτελεί μια σημαντική θέση πρόσδεσης των ιντεγκρινών σε αρκετά συστατικά της ΕΘΟ. Τα συνθετικά RGD πεπτίδια μπορούν να αναστείλουν την αλληλεπίδραση των κυττάρων με τα συστατικά της ΕΘΟ που φέρουν την αλληλουχία RGD, η οποία είναι απαραίτητη για τη κυτταρική προσκόλληση και τη διήθηση των ιστών.Σε προκλινικές μελέτες, η αναστολή της λειτουργίας της ιντεγκρίνης ανβ3 κατέστειλε αποτελεσματικά την αγγειογένεση και ανέστειλε την εξέλιξη των όγκων. Αυτά τα ενθαρρυντικά αποτελέσματα οδήγησαν τους ερευνητές και τη βιομηχανία στην ανάπτυξη φαρμάκων αναστολέων της ιντεγκρίνης ανβ3 προκειμένου να πραγματοποιηθούν κλινικές δοκιμές. Όμως, τα αποτελέσματα των κλινικών δοκιμών δεν είχαν την επιτυχία που αναμενόταν. Βέβαια, οι περισσότερες προκλινικές μελέτες πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση καθιερωμένων καρκινικών κυτταρικών σειρών λόγω του εύκολου χειρισμού τους, του μεγάλου αριθμού κυττάρων και του υψηλού βαθμού ομοιογένειας που παρουσιάζουν. Ωστόσο, οι κυτταρικές σειρές μπορεί να παρουσιάζουν φαινοτυπικές αποκλίσεις από τον αρχικό όγκο από τον οποίο προήλθαν λόγω των γονοτυπικών και φαινοτυπικών αλλαγών που έχουν υποστεί κατά τη διάρκεια των συνεχών καλλιεργειών. Αντίθετα, οι πρωτογενείς καλλιέργειες που αναπτύσσονται άμεσα από τους όγκους έχουν το πλεονέκτημα ότι τα καλλιεργούμενα κύτταρα απομονώνονται απευθείας από την πρωτοπαθή εστία του όγκου και ο φαινότυπος τους αναπαριστά σε σημαντικό βαθμό τη παθοβιολογία του αρχικού όγκου. Επίσης, τα κύτταρα καλλιεργούνται για μικρό χρονικό διάστημα και έχουν ελάχιστες πιθανότητες να υποστούν γονοτυπικούς μετασχηματισμούς. Με βάση τα παραπάνω, σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν να αναπτυχθεί ένα πειραματικό μοντέλο πρωτογενών καλλιεργειών από βιοψίες μαστού για να μελετηθεί η έκφραση της ανβ3 και ο ρόλος της στην προσκολλητική και μεταστατική ικανότητα των καρκινικών κυττάρων μαστού μετά την επίδραση ενός RGD πεπτιδίου.Πρωτογενείς καλλιέργειες από βιοψίες καρκινωμάτων μαστού και ινοαδενωμάτων αναπτύχτηκαν σε τεχνητό υπόστρωμα βιτρονεκτίνης χρησιμοποιώντας τη μη ενζυμική μέθοδο. Η βιτρονεκτίνη αποτελεί το κύριο μόριο πρόσδεσης και ενεργοποίησης της ιντεγκρίνης ανβ3 μέσω της RGD αλληλουχίας. Επίσης, εντοπίζεται στην ΕΘΟ των λεμφαδένων που αποτελεί την αρχική θέση μετάστασης στο καρκίνο του μαστού και έχει βρεθεί ότι συσσωρεύεται τοπικά στην ΕΘΟ καρκινωμάτων μαστού. Οι συνθήκες των καλλιεργειών που εφαρμόστηκαν ευνοούν την ανάπτυξη καρκινικών επιθηλιακών κυττάρων (~80%) και ενός ελεγχόμενου ποσοστού ινοβλαστών (~20%). Η παρουσία ινοβλαστών στις αναπτυσσόμενες πρωτογενείς καλλιέργειες θεωρείται απαραίτητη, καθώς προσομοιάζει καλύτερα το in vivo μικροπεριβάλλον του όγκου. Συγκεκριμένα, οι ινοβλάστες έχει βρεθεί ότι αλληλεπιδρούν με τα καρκινικά κύτταρα σε όλα τα στάδια εξέλιξης του όγκου και ενισχύουν τη μεταστατική διαδικασία.Στη παρούσα εργασία, για πρώτη φορά, μελετήθηκε η επίδραση του συνθετικού γραμμικού RGD εξαπεπτιδίου GRGDSP α) σε ιστοτεμάχια βιοψιών μαστού που προέρχονται απευθείας από την πρωτογενή εστία των όγκων καθώς και β) σε πλήρως ανεπτυγμένα καρκινικά κύτταρα μαστού από πρωτογενείς καλλιέργειες που αναπτύχθηκαν με την τεχνική του ιστοτεμαχίου, με σκοπό να αποσαφηνιστεί ο ρόλος αυτού του πεπτιδίου στην προσκόλληση και τη κινητικότητα αυτών των κυττάρων μέσω της έκφρασης της ιντεγκρίνης ανβ3 και της κατανομής του κυτταροσκελετού της ακτίνης. Επίσης, μελετήθηκε ο μηχανισμός ανακύκλωσης της ιντεγκρίνης ανβ3 σε καρκινικά κύτταρα μαστού από πρωτογενείς καλλιέργειες και η επίδραση του γραμμικού εξαπεπτιδίου GRGDSP στη πορεία αυτή.Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η συνεχής επώαση των ιστοτεμαχίων βιοψιών μαστού για μια εβδομάδα με το RGD πεπτίδιο προκάλεσε πλήρη αναστολή της μετανάστευσης των κυττάρων από τα ιστοτεμάχια, όπως φάνηκε στο SEM. Επίσης, σύμφωνα με τα αποτελέσματα στο ΤΕΜ, τα καρκινικά κύτταρα μαστού συναθροίστηκαν στη περιφέρεια των ιστοτεμαχίων και ο συνδετικός ιστός του στρώματος διατήρησε τη φυσιολογική εμφάνιση του.Η επώαση των καλά ανεπτυγμένων καρκινικών κυττάρων μαστού με το RGD πεπτίδιο για 2h προκάλεσε το στρογγύλεμα και τη συρρίκνωση των κυττάρων, το οποίο συνοδεύτηκε από αλλαγή στη κατανομή της ιντεγκρίνης ανβ3 και του κυτταροσκελετού της ακτίνης. Συγκεκριμένα, σε κάποια κύτταρα, η επώαση με το RGD πεπτίδιο προκάλεσε την αποκόλληση του κεντρικού κυτταρικού σώματος από το υπόστρωμα, αποδιοργανώνοντας τις θέσεις εστιακής προσκόλλησης στις θέσεις αυτές, ενώ τα κύτταρα παρέμειναν προσκολλημένα μέσω των λαμελιποδίων και των φιλοποδίων στη περιφέρεια των κυττάρων. Στα κύτταρα αυτά, το πρότυπο κατανομής της ανβ3 μετατοπίστηκε στη περιφέρεια υπό τη μορφή γραμμικών συναθροίσεων στις θέσεις που τα κύτταρα παραμένουν προσκολλημένα ενώ αντίστοιχα ο κυτταροσκελετός της ακτίνης αποδιοργανώθηκε στο κεντρικό κυτταρικό σώμα και διατήρησε την ινώδη εμφάνισή του στη περιφέρεια των κυττάρων. Στα κύτταρα που η επώαση με το RGD προκάλεσε πλήρη αποστρογγυλοποίηση, η ιντεγκρίνη ανβ3 παρουσίασε ένα διάχυτο πρότυπο κατανομής σε όλη τη κυτταρική επιφάνεια ενώ ο κυτταροσκελετός της ακτίνης αποδιοργανώθηκε πλήρως. Επιπλέον, στα καρκινικά κύτταρα διηθητικού πορογενούς καρκινώματος βαθμού κακοήθειας ΙΙ, το RGD προκάλεσε εντονότερες μορφολογικές επιδράσεις σε σχέση με τα καρκινικά κύτταρα βαθμού κακοήθειας ΙΙΙ. Αντίθετα, η επώαση με το RGD πεπτίδιο των κυττάρων ινοαδενώματος, στα οποία τα επίπεδα έκφρασης της ανβ3 είναι πολύ χαμηλά, δεν προκάλεσε αλλαγές στη μορφολογία τους και στη κατανομή της ιντεγκρίνης ανβ3 και του κυτταροσκελετού της ακτίνης.Η ανοσοεντόπιση της ιντεγκρίνης ανβ3 με τη μέθοδο του κολλοειδούς χρυσού στο TEM, επιβεβαίωσε την αυξημένη εντόπιση της ιντεγκρίνης ανβ3 στη περιφέρεια των κυττάρων καθώς και την αποδιοργάνωση των θέσεων εστιακής προσκόλλησης μετά την επώαση των κυττάρων με το RGD. Επιπλέον, η ιντεγκρίνη ανβ3 εντοπίστηκε σε μη καλυμμένα κυτταροπλασματικά κυστίδια αποδεικνύοντας έναν πιθανό ανεξάρτητο της κλαθρίνης μηχανισμό ανακύκλωσης της ιντεγκρίνης αυτής στα καρκινικά κύτταρα μαστού από πρωτογενείς καλλιέργειες. Ο διπλός ανοσοφθορισμός της ιντεγκρίνης ανβ3 με την GTPάση Rab11 καθώς και με τη GTPάση Rab4 έδειξε ότι ο κύριος μηχανισμός ανακύκλωσης της ιντεγκρίνης ανβ3 στα καρκινικά κύτταρα μαστού από πρωτογενείς καλλιέργειες φαίνεται να είναι το εκτενές μονοπάτι καθώς στα περισσότερα κυτταροπλασματικά κυστίδια της ιντεγκρίνης ανβ3 παρατηρείται συνεντόπιση με την GTPάση Rab11. Η επώαση των κυττάρων με το RGD πεπτίδιο δε προκάλεσε αλλαγή του μηχανισμού ανακύκλωσης της ιντεγκρίνης ανβ3, καθώς συνεχίζει να ακολουθεί το εκτενές μονοπάτι. Παρατηρείται όμως αυξημένος ρυθμός ανακύκλωσης της ιντεγκρίνης ανβ3 στις κυτταρικές προσεκβολές, ο οποίος πιθανόν να εξυπηρετεί στη μεταφορά της στις περιοχές των κυττάρων που παραμένουν προσκολλημένες στο υπόστρωμα μετά την επίδραση του RGD πεπτιδίου.Τέλος, σύμφωνα με τα αποτελέσματα του ημιποσοτικού RT PCR και του ανοσοστυπώματος κατά Western, η επώαση των καρκινικών κυττάρων μαστού με το RGD πεπτίδιο δεν επηρεάζει την έκφραση της ιντεγκρίνης ανβ3 και συνεπώς η αλλαγή στη κατανομή της ιντεγκρίνης ανβ3 είναι αποτέλεσμα της πλευρικής διάχυσης στην πλασματική μεμβράνη και της διακίνησης της ιντεγκρίνης αυτής.Συμπερασματικά, το μοντέλο των πρωτογενών καλλιεργειών καρκινικών κυττάρων μαστού που αναπτύχθηκε με τη τεχνική του ιστοτεμαχίου, θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί μελλοντικά σαν ένα πειραματικό μοντέλο για την ανάπτυξη αποτελεσματικών αντιμεταστατικών θεραπειών στον καρκίνο του μαστού μέσω της αναστολής της ιντεγκρίνης αvβ3.
Breast cancer is the most common cancer in women around the world. The major cause of death among breast cancer patients is the development of metastatic lesions at distant sites from the primary tumor, such as the bones, lungs, liver and brain. Metastasis is a multistage process in which cancer cells invade the surrounding connective tissue, enter the circulation and eventually extravasate and proliferate at the new site.Many of these steps involve integrins, a family of transmembrane adhesion receptors that connect the cytoskeleton to the extracellular matrix (ECM) and/or adjacent cells. Integrins comprise a family of at least 24 transmembrane heterodimers formed by the non-covalent associations between 18 alpha and 8 beta subunits. Their heterodimeric composition generally confers to ligand specificity, according to which they are classified in four classes, those that recognize collagen, laminin, the tripeptide sequence Arg-Gly-Asp (RGD), and several specific leukocyte associated ligands. Upon ligand binding, the cytoplasmic domain of the integrin beta-subunit associates with structural and signaling cytosolic proteins resulting in integrin clustering, organization of the cytoskeleton, and initiation of signaling events essential for cell adhesion, spreading, migration, proliferation, survival and differentiation.The regions of the plasma membrane where integrins connect actin cytoskeleton to ECM are specialized adhesive structures called focal contacts. Cell migration is sustained by the continuous growth of actin filaments at the leading edge, and the controlled retraction of adhesive contacts at the rear of the cell. A combination of targeted internalization/recycling and slow lateral diffusion in the plasma membrane drive integrins to the newly forming focal contacts at the leading edge of migrating cells. Recent studies describing integrin trafficking prompted proposals that the internalization of integrin heterodimers from the plasma membrane into endosomal compartments and the subsequent recycling back to the cell surface regulates cell migration and invasion.Specifically, integrin alphavbeta3 – a vitronectin receptor – binds to extracellular matrix molecules via an RGD-binding site and it has been implicated in the pathophysiology and progression of several malignant tumors, such as melanoma, glioma, ovarian, prostate and breast cancer. In breast cancer cells, high expression of activated integrin alphavbeta3 – but not that of non-activated integrin alphavbeta3 – is associated with a highly aggressive metastatic phenotype, signaling the onset of widespread metastasis.Integrin alphavbeta3-blocking strategies have been developed to treat a large number of diseases. In in vitro studies, the use of antagonists to integrin alphavbeta3, comprising RGD peptides, small molecule compounds, peptidomimetics, disintegrins and monoclonal antibodies have been employed. The RGD sequence is an important cell attachment recognition site for integrins in many ECM components. Synthetic RGD peptides can inhibit the interactions of cells with RGD-containing ECM adhesion proteins which are necessary for cell attachment and invasion through tissues.In preclinical studies, inhibition of integrin alphavbeta3 function efficiently suppressed angiogenesis and inhibited tumor progression. These encouraging preclinical results stimulated researchers and industry to develop pharmacological inhibitors of integrin alphavbeta3 function for clinical testing. However, these agents did not appear to be as successful, as it was originally hoped. In addition, most of the preclinical studies have been carried out using established breast cancer cell lines due to their easy manipulation, the infinite cell quantities and the high degree of homogeneity. However, cell lines are prone to genotypic and phenotypic alterations during their continual culture, resulting in a drift away from the phenotype of the originating tumor in vivo. On the contrary, primary cultures derived directly from tumors have the advantage that the cultured cells are directly isolated from the tumor site and their phenotype closely reflects the pathobiology of the original tumor in vivo, as cancer cells are cultured for a finite length of time and they have little opportunity to undergo genotypic transformations.Given the above, the aim of the present study was to develop an experimental model of primary cultures derived from breast biopsies to study the expression of integrin alphavbeta3 and its role in the adhesive and metastatic ability of breast cancer cells after the effect of an RGD peptide. Primary cell cultures from breast carcinoma and fibroadenoma biopsies were grown on artificial vitronectin substrate using the non enzymatic method. Vitronectin is the main ligand of integrin alphavbeta3 via the RGD sequence and it is a principal constituent of human lymph node ECM playing an important role as an initial homing molecule for metastasizing tumor cells. Specifically, in human breast carcinomas, vitronectin accumulates locally in ECM around some cancer cell clusters. The culture conditions whicj were used in this study, allowed the development of cancerous epithelial cells (~80%) as well as the controlled growth of a low number of fibroblast-like cells (~20%). The presence of the fibroblasts in the developed primary cell cultures is considered essential, resembling more closely the in vivo environment of the tumor, as they are associated with cancer cells at all stages of cancer progression and their structural and functional contributions promote the growth of mammary carcinoma cells.In the present work, the effects of synthetic linear RGD hexapeptide GRGDSP were studied, for the first time, on breast cancer tissue fragments derived directly from the primary site of tumors, as well as on well-spread human breast cancer cells from primary cultures, using the explant technique, in order to clarify the role of this peptide on the adhesion and motility of these cells through the expression of integrin alphavbeta3 and the distribution of actin cytoskeleton, affecting therefore their metastatic potential. In addition, the recycling mechanism of integrin alphavbeta3 was studied in breast cancer cells from primary cultures under the effect or not of the synthetic linear hexapeptide GRGDSP in this process.The results showed that incubation of the tissue fragments with the blocking RGD peptide from the beginning of the culture development inhibited the migration of the breast cancer cells out of them (SEM). Moreover, tissue fragments treated with the RGD peptide showed groups of breast cancer cells at the periphery of the tissue fragment as well as normal appearance of connective tissue of stroma (TEM).Incubation of well spread cells with the RGD peptide, after the development of the primary culture, induced roundness and shrinkage of breast cancer cells, and correlated with the distribution pattern of integrin alphavbeta3 and F-actin. More specifically, by means of immunofluorescence, in almost rounded breast cancer cells, integrin alphavbeta3 was observed as thin fingerlike clusters at the cell periphery, associated with filopodia and lamellipodia that were still adhered to the substrate. Moreover, at their cell periphery, actin cytoskeleton retained a fibrous appearance, while at the main cell body it was disorganized forming granular aggregations, as a result of focal contacts disassembly at this area, confirming that the central part of the cell body was partially detached from the substrate. In completely rounded breast cancer cells, after RGD treatment, integrin alphavbeta3 presented an intense bright diffuse staining pattern, while F-actin cytoskeleton was totally disrupted. In addition, in cancer cells of invasive ductal carcinoma grade II, RGD peptide caused stronger morphological effects compared with cancer cells of invasive ductal carcinoma grade III. In contrast, incubation of fibroadenoma cells with the RGD peptide, in which expression levels of integrin alphavbeta3 is very low, had no effect on the morphology of these cells as well as on the distribution pattern of integrin alphavbeta3 and the actin cytoskeleton.Immunogold ultrastructural localization of the integrin alphavbeta3 after RGD treatment is in agreement with the immunofluorescence results, since gold particles were observed as clusters near cell periphery with not well-formed stress fibers. Integrin alphavbeta3 was also detected in intracellular non-coated vesicles, indicating a possible clathrin-independent endocytosis of this integrin in primary breast cancer cells. Double immunofluorescence of integrin alphavbeta3 with GTPase Rab11 as well as integrin alphavbeta3 with GTPase Rab4 showed that the main recycling mechanism of integrin alphavbeta3 in primary breast cancer cells seems to be the long-loop pathway since in the majority of integrin alphavbeta3 cytoplasmic vesicles, there was co-localization with GTPase Rab11. Incubation of cancer cells with the RGD peptide caused no change in the recycling mechanism of integrin alphavbeta3, which continues to be through the long-loop pathway. However, there is an increased rate of recycling of integrin alphavbeta3 in cellular protrusions, which may serve to transfer this integrin to regions of cells that still remain attached to the substrate after the effect of the RGD peptide.Finally, RT PCR and Western immunoblotting for the integrin beta3 subunit was performed in order to examine if the change in the distribution pattern of integrin alphavbeta3, caused by RGD peptides, was also accompanied by changes in the expression of this integrin. Together with immunofluorescence and immunogold observations, RT PCR and Western immunoblotting results indicate that the altered distribution of integrin alphavbeta3 after RGD treatment is not combined with altered expression levels but probably results from lateral diffusion and trafficking of this integrin.In conclusion, the used model system of primary breast cancer cell cultures developed by the explant technique, could potentially be used in the future as an experimental tool for developing efficiently anti-integrin alphavbeta3 treatment for breast cancer.

Primary cell cultures
RGD peptides
Πρωτογενείς κυτταρικές καλλιέργειες
Integrin alphavbeta3
Ultrastructure
Cell adhesion
Κυτταρική προσκόλληση
RGD πεπτίδια
Διηθητικό πορογενές καρκίνωμα μαστού
Ιντεγκρίνη αν β3
Υπερμικροσκοπική δομή
Infiltrating ductal breast carcinoma

Εθνικό Κέντρο Τεκμηρίωσης (ΕΚΤ) (EL)
National Documentation Centre (EKT) (EN)

Greek

2011


National and Kapodistrian University of Athens
Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών (ΕΚΠΑ)



*Institutions are responsible for keeping their URLs functional (digital file, item page in repository site)