Rhesus D (RhD) system incompatibility between a pregnant woman and her fetus can result in maternal alloimmunization and hemolytic disease of the fetus /newborn (HDFN) in subsequent pregnancies. Routine antenatal anti-D administration to all RhD-negative pregnant women significantly prevents the occurrence of HDFN. Based on this prophylactic approach, however, anti-D is unnecessarily given to approximately 40% of RhD-negative women carrying RhD-negative fetuses, thus wasting time, money and valuable anti-D. In addition, since anti-D is produced from pooled plasma obtained from immunized RhD-negative donors its use is related to risks associated with administration of human blood products. Prenatal determination of fetal RhD status can be performed using fetal genetic material obtained through amniocentesis or CVS sampling. These invasive procedures, however, carry an approximately 0.5-1% risk of miscarriage and most importantly, they may lead to immunization due to feto-maternal hemorrhage. The development of safer methods using cell-free fetal DNA (cffDNA) for obtaining fetal genetic material for RHD prenatal detection, offers significant potential for the management of RhD-negative pregnant women. The aim of the present study was to design, optimize and validate protocols for reliable and accurate non-invasive prenatal determination of the fetal RhD status, using cffDNA isolated from RhD-negative pregnant women plasma. Blood samples from 132 RhD-negative pregnant women (7-24 weeks of gestation) were analyzed. Protocols were validated using 84 samples. Following that, the approved protocol was applied for routine clinical use in 48 samples. In the 1st part of the study, fetal RhD status was determined using RTQ-PCR for RHD exon 7 sequence detection. SRY gene sequences were analyzed in a separate reaction in order to confirm the presence of cffDNA in the sample tested. Diagnosis was accurate in 37/40 cases (92.5%). 30/32 RhD-positive and 7/8 RhD-negative fetuses were successfully diagnosed (93.8% sensitivity and 87.5% specificity). In the 2nd part of the study, a protocol for non-invasive prenatal diagnosis of fetal RhD status was designed which could verify the presence of cffDNA in maternal plasma, independently of fetal gender or parental polymorphisms. The protocol involved enzyme digestion of maternal plasma cell-free DNA (cfDNA), using a methylation specific endonuclease (AciI), followed by a multiplex PCR that allowed simultaneous amplification of exons 7 and 10 of the RHD gene (fetal RhD status determination), SRY to confirm the presence of cffDNA in pregnancies with male fetus, RASSF1A to confirm the presence of cffDNA and ACTB (assessment of digestion efficiency) sequences. It is known that RASSF1A sequences are hypermethylated in placenta but hypomethylated in maternal blood cells. In this case, methylation-sensitive endonuclase digests maternal hypomethylated RASSF1A sequences, leaving intact for amplification those of placental origin. During protocol validation, in 1/84 cases the presence of an RHD variant allele was suspected and the sample was excluded from the study. Fetal RhD status determination was accurate in 82/83 cases (98.8%) with 1 false-positive result. 53/53 RhD-positive and 29/30 RhD-negative fetuses were successfully diagnosed giving 100% sensitivity and 96.7% specificity. The multiplex PCR protocol was applied to 48 cfDNA samples for the clinical management of the pregnancy. All fetuses were successfully diagnosed (37 RhD-positive and 11 RhD-negative). This is the first report in the literature of a multiplex PCR based protocol for non-invasive prenatal diagnosis of fetal RhD status that can simultaneously verify the presence of cffDNA in the sample tested, thus avoiding inconclusive and false-negative results. Results indicate that the described protocol provides a good basis for routine examination of fetal RhD status by a non-invasive, risk-free method for the management of immunized RhD-negative women as well as for screening for fetal RhD typing in non-immunized, RhD-negative pregnant women. The technique is rapid, robust and in concordance with the degree of accuracy needed for non invasive fetal RHD genotyping. Its efficiency, sensitivity and specificity are similar to that obtained when RTQ-PCR is used. Since the proposed protocol requires no specially designed and expensive equipment and reagents, it is easily applicable in most molecular diagnostic laboratories.
Ανοσοποίηση λόγω ασυμβατότητας του συστήματος Rhesus D (RhD) σε κυήσεις RhD-αρνητικών γυναικών που κυοφορούν RhD-θετικό έμβρυο θεωρείται η συχνότερη αιτία αιμολυτικής νόσου του εμβρύου και του νεογνού. Πρόληψη της ευαισθητοποίησης μπορεί να πραγματοποιηθεί με χορήγηση υπεράνοσης γ-σφαιρίνης (αντί-D) σε όλες τις RhD-αρνητικές εγκύους που πιθανώς κυοφορούν RhD-θετικό έμβρυο. Η αντί-D όμως προέρχεται από ανθρώπινο ορό και θεωρητικά υπάρχει κίνδυνος μετάδοσης λοιμώδους νοσήματος. Επιπλέον τα αποθέματα αντί-D παγκοσμίως δεν είναι απεριόριστα και η οικονομική επιβάρυνση είναι σημαντική. Υπολογίζεται ότι 40% περίπου των RhD-αρνητικών εγκύων λαμβάνουν άσκοπα ανοσοπροφύλαξη αφού κυοφορούν RhD-αρνητικό έμβρυο. Προγεννητικός έλεγχος του συστήματος RhD του εμβρύου είναι εφικτός με μελέτη γενετικού υλικού του εμβρύου που λαμβάνεται με αμνιοπαρακέντηση ή βιοψία τροφοβλάστης Οι τεχνικές αυτές όμως είναι επεμβατικές και έχουν 0,5-1,0% κίνδυνο αποβολής. Επιπλέον, στις RhD-αρνητικές εγκύους, αυξάνουν τον κίνδυνο ευαισθητοποίησης της μητέρας. Η ύπαρξη ελεύθερου εμβρυϊκού DNA (cffDNA) στο περιφερικό αίμα της εγκύου έδωσε νέες δυνατότητες ανάπτυξης μη επεμβατικών τεχνικών προγεννητικού ελέγχου. Σκοπός της μελέτης είναι η προτύπωση και κλινική αξιολόγηση μεθόδων για αξιόπιστο μη επεμβατικό προσδιορισμό του συστήματος RhD του εμβρύου με ανίχνευση αλληλουχιών του RHD γονιδίου σε cffDNA που απομονώνεται από το πλάσμα RhD-αρνητικών εγκύων. Μελετήθηκαν 132 δείγματα περιφερικού αίματος RhD-αρνητικών εγκύων (7-24 εβδομάδες κύησης) από τα οποία 84 χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση των τεχνικών και 48 στη φάση της κλινικής εφαρμογής. Στην 1η φάση, ο προσδιορισμός του συστήματος RhD του εμβρύου έγινε με ανίχνευση του εξονίου 7 του RHD γονιδίου με RTQ-PCR. Για επιβεβαίωση της παρουσίας cffDNA χρησιμοποιήθηκε η αλληλουχία SRY του χρωμοσώματος Υ. Η διάγνωση ήταν ακριβής σε 37/40 δείγματα (92.5%). Διαγνώστηκαν επιτυχώς 30/32 RhD-θετικά και 7/8 RhD-αρνητικά έμβρυα (ευαισθησία 93.8% και ειδικότητα 87.5%). Στη 2η φάση προτυπώθηκε μεθοδολογία που επιβεβαιώνει την παρουσία εμβρυϊκού υλικού στο δείγμα με δείκτη ανεξάρτητο του φύλου ή πολυμορφισμών του εμβρύου. Βασίζεται στο πολλαπλό PCR μετά από ενζυμική πέψη με ευαίσθητη στη μεθυλίωση περιοριστική ενδονουκλεάση (AciI). Το πολλαπλό PCR περιλαμβάνει 5 ζεύγη εκκινητών για τον ταυτόχρονο πολλαπλασιασμό των εξονίων 7 και 10 του RHD γονιδίου (καθορισμός του συστήματος RhD του εμβρύου), του γονιδίου SRY (δείκτης παρουσίας cffDNA σε κυήσεις με έμβρυο αγόρι), του υποκινητή του ογκοκατασταλτικού γονιδίου RASSF1A (δείκτης παρουσίας cffDNA) και του υποκινητή του γονιδίου ACTB (εσωτερικός μάρτυρας επιτυχούς ενζυμικής πέψης). Πρέπει να σημειωθεί ότι ο υποκινητής του RASSF1A είναι μεθυλιωμένος στα κύτταρα του πλακούντα και μη μεθυλιωμένες στα κύτταρα της μητρικής κυκλοφορίας οι οποίες και απομακρύνονται μετά από τη ενζυμική πέψη. Στη φάση αξιολόγησης της μεθοδολογίας, σε 1/84 έμβρυα διαπιστώθηκε πιθανή πολυμορφία του RHD και αποκλείστηκε από τη μελέτη. Ο προσδιορισμός του συστήματος RhD ήταν ακριβής σε 82/83 έμβρυα (98.8%) και παρατηρήθηκε 1 ψευδώς θετικό αποτέλεσμα. Διαγνώστηκαν επιτυχώς 53/53 RhD-θετικά και 29/30 RhD-αρνητικά έμβρυα (ευαισθησία 100% και ειδικότητα 96.7%). Κατά την κλινική εφαρμογή της μεθόδου σε 48 δείγματα, με τη χρήση του πολλαπλού PCR η διάγνωση ήταν επιτυχής σε όλα τα έμβρυα (37 RhD-θετικά και 11 RhD-αρνητικά). Η μεθοδολογία πολλαπλού PCR που σχεδιάστηκε στη μελέτη είναι πρωτότυπη διεθνώς και πλεονεκτεί γιατί εκτός από τη διάγνωση του συστήματος RhD του εμβρύου επιβεβαιώνει ταυτόχρονα την παρουσία εμβρυϊκού υλικού στο δείγμα. Με τον τρόπο αυτό διευκολύνεται η διάγνωση και σχεδόν μηδενίζεται η πιθανότητα ψευδώς αρνητικών αποτελεσμάτων. Γνώση του συστήματος RhD του εμβρύου μπορεί να περιορίσει τη χορήγηση αντί-D μόνο σε όσες έγκυες γυναίκες υπάρχει πραγματική ένδειξη. Σε περίπτωση ήδη ευαισθητοποιημένης εγκύου πρώιμη ανίχνευση του συστήματος RhD του εμβρύου μπορεί να συμβάλλει αποφασιστικά στο τρόπο παρακολούθησης κάθε εγκυμοσύνης, δεδομένου ότι οι κυήσεις ευαισθητοποιημένων RhD-αρνητικών γυναικών που κυοφορούν RhD-θετικό έμβρυο είναι υψηλού κινδύνου για την εμφάνιση αιμολυτικής νόσου του νεογνού ή του εμβρύου.
