Ο κρόκος είναι ένα πολυετές, βολβώδες φυτό, το οποίο ανήκει στην οικογένεια των Ιριδοειδών και ευδοκιμεί κυρίως στις χώρες της Μεσογείου και της Νοτιοδυτικής Ασίας. Απαντάται ως αυτοφυές φυτό αλλά και καλλιεργούμενο. Η καλλιέργεια του κρόκου πραγματοποιείται στην Ελλάδα, τη Μεσόγειο, τη Μέση Ανατολή και την Κίνα καθώς από τους στύλους του παράγεται το ευρέως γνωστό σαφράν. Μέχρι σήμερα έχουν καταγραφεί παγκοσμίως 160 είδη του γένους Crocus από τα οποία τα 30 φύονται στην Ελλάδα με 19 από αυτά να είναι ενδημικά. Ο Crocus sativus είναι ο πιο γνωστός εκπρόσωπος του γένους, ο οποίος στην Ελλάδα καλλιεργείται συστηματικά στην περιοχή της Κοζάνης. Μέχρι σήμερα έχει αποσαφηνιστεί η χημική του σύσταση καθώς επίσης έχουν μελετηθεί και πολλές από τις φαρμακευτικές του ιδιότητες. Ανάμεσα στα συστατικά των στύλων του κρόκου κυρίαρχες είναι οι κροκίνες και τα φλαβονοειδή, ενώ στο αιθέριο έλαιο του επικρατεί η σαφρανάλη.
Στην παρούσα έρευνα, μελετήθηκε η φυτοχημική σύσταση των στύλων τριών διαφορετικών taxa, του Crocus nivalis και του Crocus olivieri από την περιοχή του Παναχαϊκού Όρους και του Crocus veluchensis από την περιοχή του Τυμφρηστού Όρους και συγκρίθηκαν με αυτή του Crocus sativus από την περιοχή της Κοζάνης. Αρχικά, αναλύθηκαν οι στύλοι των C. olivieri και C. veluchensis ως προς το περιεχόμενο τους σε πτητικά συστατικά όπου τα αποτελέσματα έδειξαν παντελή απουσία πτητικών συστατικών. Στην συνέχεια αναλύθηκε η ποιοτική και ποσοτική σύσταση του μεθανολικού εκχυλίσματος των στύλων και των τεσσάρων ειδών με τις τεχνικές HPLC-DAD, UPLC-MS και UΗPLC-MS. Τα χρωματογραφήματα αποκάλυψαν σημαντικές διαφορές στη σύσταση τους. Συνολικά, ταυτοποιήθηκαν 8 συστατικά στο εκχύλισμα του C. sativus, 11 συστατικά στο εκχύλισμα του C. olivieri μεταξύ των οποίων η trans-κροκίνη 9, η οποία δεν έχει αναφερθεί προηγουμένως στους στύλους άλλου Crocus taxon, 22 συστατικά στο εκχύλισμα του C. nivalis και 25 συστατικά στο εκχύλισμα του C. veluchensis μεταξύ των οποίων και δύο κροκίνες που περιέχουν ομάδες ραμνόζης στη δομής τους οι οποίες δεν έχουν περιγραφεί προηγουμένως.
Για τον ποσοτικό προσδιορισμό των κύριων συστατικών των τεσσάρων διαφορετικών ειδών κρόκου απομονώθηκαν με ημιπαρασκευαστικό HPLC από το εκχύλισμα του C. sativus και του C. nivalis έξι ενώσεις μεταξύ των οποίων η trans-κροκίνη 6, η trans-κροκίνη 4, η trans-κροκίνη 3, η trans-κροκίνη 3’, η trans-κροκίνη 2 και η καμφερόλη 3-σοφοροζίτης. Για καθένα από τα συστατικά αυτά κατασκευάστηκε μια πρότυπη καμπύλη βαθμονόμησης μέσω των τεχνικών του UPLC-MS αρχικά και του HPLC-DAD στη συνέχεια. Όλες οι καμπύλες κατέδειξαν πολύ καλή γραμμικότητα και επίσης υπολογίστηκαν και με τις 2 τεχνικές τα κατώτατα όρια ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης των συστατικών (Lower Limit of Detection/Quantitation, LLOD/LLOQ).
Η trans-κροκίνη 6 ήταν η επικρατέστερη στο C. nivalis με συγκέντρωση 116,2±12,2 mg/g ξηρού στύλου μέσω HPLC-DAD και 88,7±2,7 mg/g ξηρού στύλου μέσω UPLC-MS, ενώ επίσης η ίδια βρέθηκε να είναι το κύριο συστατικό και στο εκχύλισμα του C. veluchensis με συγκέντρωση 34,6±0,3 mg/g ξηρού στύλου μέσω HPLC-DAD και 24,5±0,5 mg/g ξηρού στύλου μέσω UPLC-MS. Στον C. sativus επικρατεί ποσοτικά η trans-κροκίνη 4 με συγκέντρωση 146,1±11,3 mg/g ξηρού στύλου μέσω HPLC-DAD και 113,2±4,5 mg/g ξηρού στύλου μέσω UPLC-MS ενώ στους στύλους του C. olivieri κύριο συστατικό με διαφορά είναι το φλαβονοειδές κερσετίνη-γλυκοζίτης-ραμνοζίτης με 78,0±2,1 mg/g ξηρού στύλου μέσω HPLC-DAD και 57,9±0,6 mg/g ξηρού στύλου μέσω UPLC-MS. Τα ποσοτικά αυτά στοιχεία που αφορούν τον C. veluchensis, C. olivieri και C. nivalis παρουσιάζονται για πρώτη φορά καθώς δεν έχει πραγματοποιηθεί αντίστοιχη μελέτη της χημικής σύστασης των τριών αυτών ανοιξιάτικων ειδών κρόκου μέχρι σήμερα.
Crocus is a perennial, bulbous plant that belongs to the Iridacea family and thrives mainly in the countries of the Mediterranean and Southwest Asia. It is found as a native plant and is also cultivated because of the great commercial importance value of its styles, the well-known spice saffron. Until today, 160 species of the genus Crocus have been recorded worldwide, 30 of which grow in Greece and 19 of them are endemic. Crocus sativus is the most famous representative of the genus and in Greece it is systematically cultivated in the region of Kozani. To date, its chemical composition has been clarified and many of its medicinal properties have also been studied. Among the ingredients of the styles of Crocus species, crocins and flavonoids are predominant, while in the essential oil safranal is predominant.
In the present research, the phytochemical composition of styles of three different taxa of the genus Crocus, Crocus nivalis and Crocus olivieri from the area of Mount Panachaikos and Crocus veluchensis from the area of Mount Timphristos, was studied and compared to that of Crocus sativus from the region of Kozani. Initially, the styles of C. olivieri and C. veluchensis were analyzed for their content in volatile components where the results showed the complete absence of them. Then, styles of the four different species were analyzed for their qualitative and quantitative composition of their methanolic extracts with the techniques of HPLC-DAD, UPLC-MS and UHPLC-MS. The chromatographic profiles of the four species differed significantly. A total of 8 components were identified in C. sativus extract, 11 components in C. olivieri extract, including, trans-crocin 9, that has not been previously reported in other Crocus taxon, 21 components in C. nivalis extract, and finally 25 components in the extract of C. veluchensis including two crocins containing rhamnose in their structure and also not previously described.
To quantify the main components of the four different Crocus species, six compounds including trans-crocin 6, trans-crocin 4, trans-crocin 3, trans-crocin 3', trans-crocin 2 and kaempferol 3-sophoroside were isolated with semi-preparative HPLC from the extracts of C. sativus and C. nivalis. For each of these components, a standard calibration curve was constructed using the technique of UPLC-MS at first and then HPLC-DAD. All curves showed very good linearity and the lower limits of detection and quantification (LLOD / LLOQ) were calculated with both techniques for each compound.
Trans-crocin 6 was more prevalent in styles of C. nivalis with a concentration of 116.2±12.2 mg/g dry style via HPLC-DAD and 88.7±2.7 mg/g dry style via UPLC-MS. The same was also found to be the main constitute in C. veluchensis extract with a concentration of 34.6±0.3 mg/g dry style via HPLC-DAD and 24.5±0.5 mg/g dry style via UPLC-MS. Trans-crocin 4 is predominant at styles of C. sativus with a concentration of 146.1±11.3 mg/g dry style via HPLC-DAD and 113.2±4.5 mg/g dry style via UPLC-MS while in styles of C. olivieri the main compound by difference is the flavonoid quercetin-3-Ο-glucoside-7-Ο-ramnoside with a concentration of 78.0±2.1 mg/g dry style via HPLC-DAD and 57.9±0.6 mg/g dry style via UPLC-MS. These quantitative data concerning C. veluchensis, C. olivieri and C. nivalis are presented for the first time since no study of the chemical composition of those three species of spring-flowering crocuses has been carried out before.
