New hplc analytical method for the determination of ibuprofen and naproxen derivatives. Study of their access to the central nervous system

see the original item page
in the repository's web site and access all digital files if the item*

2007 (EN)
Ανάπτυξη μεθόδου ανάλυσης παραγώγων της ιβουπροφαίνης και της ναπροξένης με υγρή χρωματογραφία υψηλής πίεσης. Μελέτη ικανότητας πρόσβασης αυτών στο Κεντρικό Νευρικό Σύστημα
New hplc analytical method for the determination of ibuprofen and naproxen derivatives. Study of their access to the central nervous system

Ξανθοπούλου, Νικολέτα Ιωάννη

The rise in life expectancy during the last decades has increased the rate of neurodegenerative disorders. Alzheimer’s disease (AD) along with cardiovascular diseases and cancer are the top causes of morbidity. At the age of 65 only 5% is affected by AD but every five years this percentage is doubled. AD is a social – economical issue for the western world.Although recent advances in biotechnology and pharmaceutical sciences have expanded the number of drugs for treating central nervous system disorders, such as neurodegenerative diseases, due to the blood brain-barrier, the majority of drugs developed for Central Nervous System disorders do not reach their intercerebral targets. It appears interesting to design and synthesize molecules for the treatment of Alzheimer disease. Moreover it is a pharmacological challenge, since there is still enough uncertainty about the molecular pathogenesis of nerve cell death and there has not been a really effective intervention yet.The major pathobiochemical changes in the demented brain are: the appearance of neurofibrillary tangles intracellularly and amyloid plaques extracellularly. At the same time, oxidative stress, inflammation and excitotoxicity appear in the demented brain. Disorders of homeostasis of Fe++(+)/Ca++ contribute to structure and functionality changes of nerve membranes and other endoskeletal components. Hypercholesterolemia raises the risk of appearance of AD by contributing to the gradual vessel malfunction and consequently to nerve inflammation.Therefore, there are several targets for the medicinal treatment of cognition disorders and the potential of multifunctional therapeutic agents of complex neurodegenerative diseases has already been considered. In this scope, molecules were designed and synthesized with structural moieties capable of targeting several pathobiochemical changes. Molecules exhibiting anti-inflammatory, antioxidant and nootropic action. Should some of these molecules bear hypocholesterolemic action, they would contribute more to the multi targeted treatment of the AD. In this work, six derivatives of ibuprofen and naproxen1,2 two known non-steroidal anti-inflammatory drugs, were used. These derivatives are known to maintain their anti-inflammatory properties. Both ibuprofen and naproxen were connected, via an amide bond, with an L-proline or trans-4-hydroxy-proline moiety, expected to contribute to the nootropic properties and proline’s carboxylic group has further been converted to amide with L-cysteine ethyl ester or cysteamine, two known antioxidants with low general toxicity. In this manner, the new molecules exhibit antioxidant as well as anti-inflammatory properties and lower gastrointestinal toxicity which was largely due to the free carboxylic acid of the two non-steroidal anti-inflammatory drugs, ibuprofen and naproxen.During this project, these compounds were synthesized again from the known non-steroidal anti-inflammatory drug and their structures were confirmed by IR spectroscopy, melting points of the intermediate and final products and thin layer chromatography (comparison with bibliography compounds).During the pharmacochemical study of the compounds under investigation, their calculated lipophilicity (CLogP) and ability to pass through biological membranes as well as their molecular volume were estimated theoretically. According to the “rule of five”, all compounds seem to be capable of passing through biological membranes with small variations.Furthermore, since all compounds have been designed to act in the central nervous system (CNS), a prerequisite for their activity is their ability to pass the blood-brain barrier (BBB). A method to predict the ability of compounds for BBB penetration is the calculation of their molecular polar surface area (PSA). In a set of 125 different drugs, it has been shown that all those demonstrating CNS activity could be found within a PSA range not higher than 90Ε. The topological polar surface area (TPSA) was calculated according to the literature and the results indicated that all derivatives may easily enter CNS with the exception of an ethyl ester whose capacity to penetrate BBB is slightly reduced.The next step was to confirm the entrance of the compounds under study to the CNS by determining their concentration in rat brain homogenates after treatment with the above derivatives. For this determination, a new solid phase extraction preparation method was developed followed by a HPLC analysis method.The successful application of the method was tested with the recovery determination of known amounts of the derivatives under study, added in blank samples of rat brain homogenates in three concentration levels covering the linear range of concentrations. Under the adopted elution conditions the recoveries were within the acceptable range of 70-120% with one exception which was attributed to low concentration levels.The HPLC analysis method is a gradient elution method with a UV-detector. For every derivative under study the limit of detection (MDL) and the limit of quantitation (MQL) were determined. In order to validate the method, its efficiency characteristics such as intraday and interday repeatability and trueness were determined with liquid fortified blanks (rat brain homogenates with no treatment). For all the derivatives apart from one there were no peaks near them. Derivatives with similar retention times were analyzed separately. MDLs and MQLs were fairly low for each and every derivative and their intraday or interday repeatability were satisfying. For the majority of the derivatives trueness was far below the limit of 20% except for three derivatives for which it was around 15%.Linear regression lines with excellent linearity over the concentration range were used for the quantitation of the derivatives under study. Following the validation of the method, the determination of the derivatives’ concentration in rat brain homogenates was performed. After treatment of the rats with 0,6mmol/kg intraperitoneal injection, concentration was determined 30, 60 and 120 min post injection. From the six derivatives under study, four were traced in brain homogenates confirming the pharmacochemical study regarding their ability to access the CNS. For one of the other two derivatives, a peak from the matrix was too close to its peak interefering with the detection and the other was positively not traced under the experimental conditions. Two out of the four derivatives found in the brain were ibuprofen derivatives with proline, cysteamine and cysteine ethyl ester and the other two were naproxen derivatives with proline / HO-proline and cysteamine. Higher access percentage in the brain had the ibuprofen derivatives while longer presence in the brain in higher concentration had the naproxen derivative with HO-proline and cysteamine.For one of the derivatives, its blood levels were also determined at the same time with the brain. Its brain levels were decreasing while its blood levels were increasing from 30 to 120 min. The derivatives under study in this project had all the necessary multifunctional characteristics for the treatment of AD and four of them were found in the brain under the studied experimental conditions. Thus they penetrate the blood-brain barrier reaching CNS and prove to be a good basis for a future AD treatment or even for the design and future synthesis of new multifunctional molecules which will be able to compensate one of the greatest challenges of contemporary medicine, senile-dementia Alzheimer’s type. The merging of CNS drug-targeting with CNS drug-discovery can address the present-day challenges in CNS drug development.
Η νόσος του Alzheimer ή γεροντική άνοια προσβάλλει ολοένα μεγαλύτερο αριθμό ατόμων ειδικά στις αναπτυγμένες κοινωνίες λόγω και της αύξησης της διάρκειας ζωής. Συγκαταλέγεται μεταξύ των τριών πρώτων αιτιών νοσηρότητας μαζί με τις καρδιαγγειακές παθήσεις και τον καρκίνο. Η επίπτωση της νόσου έχει πολύ γρήγορη εξέλιξη. Στα 65 το 5% πάσχει από τη νόσο και κάθε πενταετία πάνω από τα 60 χρόνια το ποσοστό διπλασιάζεται. Η νόσος Alzheimer αποτελεί ένα κοινωνικο-οικονομικό πρόβλημα για τον δυτικό τουλάχιστον κόσμο. Παρά τις πρόσφατες εξελίξεις της βιοτεχνολογίας και της φαρμακευτικής οι οποίες έχουν αυξήσει τον αριθμό των πιθανών φαρμάκων για τη θεραπεία των δυσλειτουργιών του ΚΝΣ, η παρουσία του αιματοεγκεφαλικoύ φραγμού αποκλείει την πλειονότητα αυτών. Εμφανίζει μεγάλο ενδιαφέρον η σχεδίαση και η σύνθεση μορίων για τη θεραπεία νευροεκφυλιστικών ασθενειών. Επιπλέον είναι μια φαρμακολογική πρόκληση αφού υπάρχει ακόμη μεγάλη ασάφεια σχετικά με την παθογένεση του θανάτου των νευρώνων.Οι κύριες νευροπαθολογικές δομές που εντοπίζονται στον ανοϊκό εγκέφαλο είναι οι εξωκυτταρικές αμυλοειδείς πλάκες και οι ενδοκυτταρικοί νευροϊνώδεις κόμβοι. Σταδιακά παρατηρείται απώλεια νευρώνων και χολινεργικών συνάψεων κυρίως. Παράλληλα παρατηρείται στον εγκέφαλο πλήθος βιοχημικών μεταβολών όπως φλεγμονή, οξειδωτικό στρες, διεγερσιμοτοξικότητα. Προκαλείται διαταραχή της ομοιόστασης Fe++(+)/Ca++ η οποία οδηγεί σε αλλοίωση της δομής και λειτουργικότητας των νευρωνικών μεμβρανών και ενδοσκελετικών συστατικών. Η υπερχοληστερολαιμία συμβάλλει στον κίνδυνο εμφάνισης της νόσου προκαλώντας βαθμιαία βλάβη των αγγείων και άρα φλεγμονή και απόφραξη αυτών. Υπό το πρίσμα όλων αυτών των παθοβιοχημικών μεταβολών οι οποίες λαμβάνουν χώρα στον ανοϊκό εγκέφαλο, η ιδανική θεραπεία θα ήταν μια ταυτόχρονη αντιμετώπιση όλων αυτών των αλλαγών η οποία θα πραγματοποιούνταν με πολυλειτουργικά μόρια. Πραγματοποιήθηκε η σχεδίαση και η σύνθεση μορίων με δομικά στοιχεία δυνητικά ικανά να στοχεύουν σε περισσότερες από μια διαδικασίες παθογένεσης. Μόρια που παρουσιάζουν αντιφλεγμονώδη, αντιοξειδωτική και νευροπροστατευτική δράση. Αν κάποια από αυτά έχουν και υποχοληστερολαιμική ικανότητα τότε συμβάλλουν ακόμη περισσότερο στην πολυμέτωπη αντιμετώπιση της ασθένειας.Στα πλαίσια της διπλωματικής εργασίας χρησιμοποιήθηκαν ενώσεις γνωστές στη βιβλιογραφία1,2 οι οποίες ήταν παράγωγα γνωστών μη στεροειδών αντιφλεγμονωδών μορίων και πιο συγκεκριμένα της ιβουπροφαίνης και της ναπροξένης, και οι οποίες διατηρούν την αντιφλεγμονώδη δράση τους. Τόσο η ιβουπροφαίνη όσο και η ναπροξένη συνδέθηκαν μέσω αμιδικού δεσμού με υπόλοιπο L-προλίνης ή 4-trans-υδροξυ-προλίνης τα οποία αναμένεται να προσδώσουν στα μόρια νευροπροστατευτικές ιδιότητες. Ακολούθησε εστεροποίηση του καρβοξυλίου είτε της L-προλίνης ή της 4-trans-υδροξυ-προλίνης με κυστεαμίνη ή με αιθυλεστέρα της κυστεΐνης, δυο γνωστά αντιοξειδωτικά χαμηλής τοξικότητας. Με αυτόν τον τρόπο απέκτησαν τα μόρια αντιοξειδωτικές ιδιότητες, και μειώθηκε η γαστροτοξικότητά τους η οφειλόμενη στο ελεύθερο καρβοξύλιο. Οι ενώσεις αυτές παρασκευάστηκαν εκ νέου στα πλαίσια της διπλωματικής εργασίας και οι δομές τους επιβεβαιώθηκαν σε σύγκριση με τη βιβλιογραφία με φασματοσκοπία υπερύθρου, σημείο τήξεως και χρωματογραφία λεπτής στιβάδας. Στα πλαίσια της φαρμακοχημικής μελέτης των ενώσεων που μελετήθηκαν και δεδομένης της αναγκαιότητας διάβασης του αιματοεγκεφαλικού φραγμού για την εκδήλωση της επιθυμητής δράσης, έγινε αρχικά ο θεωρητικός προσδιορισμός της λιποφιλικότητας και της ικανότητας διάβασης βιολογικών μεμβρανών βάσει του «κανόνα των πέντε» καθώς και μέσω υπολογισμού της πολικής επιφάνειας των μορίων (τιμή TPSA) και του μοριακού όγκου. Με μικρές διαφοροποιήσεις, όλα τα παράγωγα εμφανίζονται ικανά να διαπεράσουν τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό με μια μικρή επιφύλαξη για το αιθυλεστερικό παράγωγο του οποίου η TPSA υπερβαίνει το όριο πρόσβασης στο ΚΝΣ.Το επόμενο στάδιο ήταν να επιβεβαιωθεί η θεωρητικά πιθανή πρόσβαση στο ΚΝΣ των ενώσεων αυτών και πρακτικά. Για να γίνει αυτό απαιτούνταν ο προσδιορισμός των μελετώμενων παραγώγων σε ομογενοποίημα εγκεφάλου επιμύος κατόπιν χορήγησης αυτών. Για τον προσδιορισμό των παραγώγων αναπτύχθηκε μια νέα μέθοδος προετοιμασίας με εκχύλιση στερεάς φάσης – υγρού και ανάλυσης με υγρή χρωματογραφία υψηλής πίεσης (HPLC). Η σωστή εφαρμογή της μεθόδου προετοιμασίας ελέγχθηκε με τον υπολογισμό των ανακτήσεων γνωστών ποσοτήτων των παραγώγων σε δείγμα ομογενοποιήματος εγκεφάλου επίμυος χωρίς καμιά χορήγηση («τυφλό δείγμα»), σε τρία επίπεδα συγκέντρωσης που κάλυπταν την γραμμική περιοχή της μεθόδου. Με τις υιοθετούμενες συνθήκες έκλουσης οι ανακτήσεις –εκτός από μία- ήταν μέσα στα αποδεκτά όρια του 70-120%.Η μέθοδος ανάλυσης με υγρή χρωματογραφία υψηλής πίεσης είναι μια μέθοδος βαθμωτής έκλουσης με ανιχνευτή υπεριώδους. Έγινε προσδιορισμός τόσο των ορίων ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης των μελετώμενων παραγώγων όσο και των χαρακτηριστικών επίδοσης της μεθόδου με σκοπό την επικύρωσή της, δηλαδή της ακρίβειας και της επαναληψιμότητάς της τόσο εντός όσο κι εκτός ημέρας. Για κανένα από τα παράγωγα δεν υπήρξαν παρεμποδίσεις εκτός από ένα, πολύ κοντά στο χρόνο του οποίου υπήρχε κορυφή παρεμπόδισης από το υπόστρωμα (ομογενοποίημα εγκεφάλου επίμυος) και αυτό όχι σε όλες τις αναλύσεις. Οι ενώσεις των οποίων οι χρόνοι κατακράτησης ήταν πολύ κοντά αναλύθηκαν ξεχωριστά. Τα όρια ανίχνευσης ήταν ικανοποιητικά χαμηλά για όλα τα παράγωγα και η επαναληψιμότητα των μετρήσεων τόσο εντός όσο κι εκτός ημέρας, πολύ καλή. Η ακρίβεια ήταν πολύ κάτω από το πάνω όριο του 20% της επιτρεπτής απόκλισης με εξαίρεση τρία παράγωγα στα οποία η ακρίβεια ήταν αποδεκτή μεν αλλά κοντά στο 15%.Η ποσοτικοποίηση έγινε βάσει καμπυλών αναφοράς των οποίων η γραμμικότητα ήταν πολύ καλή. Όλα τα χαρακτηριστικά επίδοσης της μεθόδου και τα όρια μελετήθηκαν σε επιμολυσμένα τυφλά δείγματα. Ακολούθησε πειραματική μελέτη πρόσβασης των παραγώγων στον εγκέφαλο με ενδοπεριτοναϊκή χορήγηση αυτών σε δόση 0,6mmol/kg επίμυος και προσδιορισμό στον εγκέφαλο των παραγώγων σε τρεις χρόνους, στα 30, 60 και 120 min από το χρόνο χορήγησης. Από τα έξι μελετώμενα παράγωγα στον εγκέφαλο ανιχνεύθηκαν τα τέσσερα επιβεβαιώνοντας τους θεωρητικούς υπολογισμούς για την πρόσβαση στο ΚΝΣ. Για το ένα παράγωγο η κορυφή παρεμπόδισης αποτελεί σημαντικό εμπόδιο προσδιορισμού και το άλλο δεν ανιχνεύθηκε υπό τις μελετώμενες συνθήκες στον εγκέφαλο. Από τα τέσσερα παράγωγα που ανιχνεύθηκαν, τα δυο ήταν παράγωγα ιβουπροφαίνης-προλίνης με κυστεαμίνη και αιθυλεστέρα της κυστεΐνης και τα άλλα δυο παράγωγα της ναπροξένης με προλίνη και ΗΟ-προλίνη και κυστεαμίνη. Μεγαλύτερο ποσοστό εισόδου είχαν τα παράγωγα της ιβουπροφαίνης και πιο μακρά παρουσία στον εγκέφαλο σε μεγαλύτερη συγκέντρωση το παράγωγο ναπροξένης-ΗΟ-προλίνης. Για ένα από τα παράγωγα προσδιορίστηκε και η συγκέντρωση αυτού στους ίδιους χρόνους στο αίμα. Η συγκέντρωση σε αυτούς τους χρόνους στον εγκέφαλο έβαινε μειούμενη από τα 30  120min ενώ στο πλάσμα έβαινε αυξανόμενη, φαινόμενο το οποίο μπορεί να οφείλεται σε ανακατανομή του παραγώγου.Η νέα μέθοδος προσδιορισμού των παραγώγων 19-24 σε ομογενοποίημα εγκεφάλου μπορεί να αποτελέσει τη βάση για τη μελέτη και άλλων παραγώγων. Η επικύρωσή της οδηγεί στην υιοθέτησή της πιστοποιημένα και μη εργαστήρια. Τα παράγωγα που μελετήθηκαν στην παρούσα διπλωματική εργασία έχουν και τα απαιτούμενα πολλαπλά χαρακτηριστικά και τα περισσότερα από αυτά υπό τις πειραματικές συνθήκες αποδείχτηκε ότι διαπερνούν τον ΒΒΒ και φτάνουν στον στόχο τους οπότε μπορούν να αποτελέσουν τη βάση για μελλοντική θεραπεία των εγκεφαλικών δυσλειτουργιών ή και τη μελλοντική σχεδίαση και σύνθεση και άλλων πολυλειτουργικών μορίων ικανών να ανταπεξέλθουν σε μια από τις μεγαλύτερες προκλήσεις της σύγχρονης ιατρικής, τη γεροντική άνοια – νόσο Alzheimer.

Postgraduate Thesis / Μεταπτυχιακή Εργασία

Υγρή χρωματογραφία υψηλής πίεσης
Αιματοεγκεφαλικός φραγμός
Μη στεροειδή αντιφλεγμονώδη
Blood brain barrien

Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης (EL)
Aristotle University of Thessaloniki (EN)



Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης, Σχολή Επιστημών Υγείας, Τμήμα Φαρμακευτικής

This record is part of 'IKEE', the Institutional Repository of Aristotle University of Thessaloniki's Library and Information Centre found at Unless otherwise stated above, the record metadata were created by and belong to Aristotle University of Thessaloniki Library, Greece and are made available to the public under Creative Commons Attribution-ShareAlike 4.0 International license ( Unless otherwise stated in the record, the content and copyright of files and fulltext documents belong to their respective authors. Out-of-copyright content that was digitized, converted, processed, modified, etc by AUTh Library, is made available to the public under Creative Commons Attribution-ShareAlike 4.0 International license ( You are kindly requested to make a reference to AUTh Library and the URL of the record containing the resource whenever you make use of this material.

*Institutions are responsible for keeping their URLs functional (digital file, item page in repository site)