Ο ανθρώπινος Κυτταρομεγαλοϊός (HCMV) είναι ένας DNA ερπητοϊός και αποτελεί ένα κοινό παθογόνο με αξιοσημείωτο κλινικό ενδιαφέρον. Για να οπτικοποιήσουμε την IE1-72K του HCMV, κατασκευάστηκε ένας ανασυνδυασμένος ιός που κωδικοποιεί την IE1 συνδεδεμένη με την φθορίζουσα EGFP. Χρησιμοποιώντας αυτόν τον ιό, η IE1-EGFP πρωτεΐνη ανιχνεύθηκε στα ND10 μέσα σε 2 h.p.i. ενώ η πλήρης διάσπαση των ND10 παρατηρήθηκε μέχρι τις 6 h.p.i. Τα HCMV DNA και η IE2-86K πρωτεΐνη ανιχνεύθηκαν παραπλεύρως των IE1-72K/ND10 εστιών. Η IE1-72K συνδέεται με τη μεταφασική χρωματίνη, παίρνοντας μαζί της τις PML, Sp100 και STAT-2. Οι πρωτεΐνες hDaxx, STAT-1 και IE2-86K δεν μετατοπίστηκαν στη μεταφασική χρωματίνη.
Καθώς η πρόοδος της μίτωσης σε μολυσμένα κύτταρα δεν έχει μελετηθεί εκτενώς, χρησιμοποιήσαμε τον ανασυνδυασμένο CR401 ιό ώστε να παρακολουθήσουμε αυτό το φαινόμενο σε ζωντανούς ινοβλάστες. Η μικροσκοπία σε ζωντανά HeLa κύτταρα που εξέφραζαν τις διαμολυσμένες EGFP-IE1 και HcRed1-H2A πρωτεΐνες έδειξε πως η ΙΕ1 συνδεόταν ξεκάθαρα με τη συμπυκνωμένη χρωματίνη σε διάφορα στάδια της μίτωσης, και τελικά τα κύτταρα που παροδικά εξέφραζαν την ΙΕ1 ολοκλήρωναν την διαίρεσή τους με επιτυχία. Μικροσκοπική παρατήρηση μεμονωμένων HCMV μολυσμένων ινοβλαστών έδειξε ότι ένα μικρό ποσοστό των κυττάρων που ξεκινούσαν τη μίτωση, προχωρούσαν στην πρόφαση και τη μετάφαση άμεσα και με ευκολία. Αντίθετα, στα ελάχιστα κύτταρα που έφταναν στην ανάφαση, τα χρωμοσώματα δεν μετατοπίζονταν ομαλά στους πόλους.
Στη μελέτη αυτή παρουσιάζεται η ικανότητα των HCMV και EBV IE πρωτεϊνών να ρυθμίζουν θετικά την έκφραση των ULBP2 και MICA/B προσδετών, προάγοντας την ΝΚ ενεργοποίηση. Μια ομάδα ανασυνδυασμένων αδενοϊών που εξέφραζαν μεταλλαγμένες μορφές της ΙΕ1 πρωτεΐνης κατασκευάστηκε και χρησιμοποιήθηκε για τη μελέτη του μηχανισμού ενεργοποίησης του ULBP2. Η ενεργοποίηση των NKG2D προσδετών φαίνεται να είναι εξαιρετικά ευαίσθητη στην έκφραση των άμεσα πρώιμων γονιδίων των ερπητοϊών.
(EL)
Human Cytomegalovirus (HCMV) is a DNA herpes virus and a common human pathogen of considerable clinical interest. To image the IE1-72kDa HCMV protein a recombinant virus encoding IE1 fused to EGFP was constructed (CR401). Using this construct, the IE1-EGFP fusion was detected at ND10 within 2 h.p.i. and the complete disruption of ND10 imaged through to 6 h p.i. HCMV genomes and IE2-86K protein could be detected adjacent to the IE1-72K/ND10 foci. IE1-72K associates with metaphase chromatin, recruiting PML, Sp100 and STAT2. hDaxx, STAT1 and IE2-86K did not re-locate to metaphase chromatin; the fate of hDaxx is particularly important as this protein contributes to an intrinsic barrier to HCMV infection.
Since the progress of mitosis in infected cells has not thoroughly studied, we used the recombinant CR401 to visualize this dynamic phenomenon in living fibroblasts. Time-lapse microscopy in transiently expressing EGFP-IE1 and HcRed1-H2A HeLa cells revealed that IE1 was clearly associated with condensed chromatin at various stages of mitosis and eventually the IE1-expressing cells successfully completed cell division. Monitoring of individually infected fibroblasts by live cell imaging showed that a small proportion of cells initiated mitosis, progressing to prometaphase and metaphase quite readily. However, in the very few cells continuing to anaphase, lagging chromosomes were evident. A destruction of the mitotic spindle because of a HCMV expressed protein results in severe chromosome segregation defects.
We demonstrate here that the HCMV and EBV IE proteins differentially upregulate expression of ULBP2 and MICA/B, promoting NK cell activation. A panel of replication-deficient adenovirus recombinants encoding defined HCMV IE1 mutants has been generated, and is being used to characterize the mechanism responsible for promoting the ULBP2 response. The NKG2D receptor thus, appears to be exquisitely sensitive to herpesvirus IE gene expression.
(EN)
