This item is provided by the institution :
University of Crete
Repository :
E-Locus Institutional Repository
see the original item page
in the repository's web site and access all digital files if the item*
share



PhD thesis (EN)

2007 (EN)
Μελέτη της ενεργοποίησης των ογκογονιδίων Tpl-2 και Gfi1 σε λεμφοειδείς νεοπλασίες
Study of the activation of the oncogenes Tpl2 and Gfi1 in lymphoid malignancies.

Χριστοφορίδου, Άννα
Christoforidou, Anna

Τσατσάνης, Χρήστος
Μαργιωρής, Ανδρέας
Μπούμπας, Δημήτριος
Σαμώνης, Γεώργιος
Αλεξανδράκης, Μιχαήλ
Παπαδάκη, Ελένη
Ηλιόπουλος, Αριστείδης

Τα γονίδια Tpl2 και Gfi1 αποτελούν σχετικά καινούρια μέλη της οικογένειας των κυτταρικών ογκογονιδίων των οποίων ο ρόλος στην ανάπτυξη και εξέλιξη ανθρώπινων νεοπλασματικών νόσων πιθανολογείται, καθώς είναι γνωστό ότι συμβάλλουν στην ανάπτυξη λεμφοειδών νεοπλασιών, κυρίως Τ-λεμφοκυτταρικής αρχής σε ζωικά πειραματικά μοντέλα. Συγκεκριμένα, η κινάση Tpl2 (ή ΜΑΡ3Κ8) όταν εκφράζεται αναδιαταγμένη (κολοβωμένη) στο καρβοξυτελικό της άκρο σε διαγονιδιακά ποντίκια προκαλεί την ανάπτυξη Τ-λεμφοβλαστικών λεμφωμάτων, ενώ και η υπερέκφραση της φυσικής πρωτεΐνης είναι ογκογόνος. Στον άνθρωπο έχει βρεθεί υπερέκφραση σε λέμφωμα Hodgkin’s, σε ρινοφαρυγγικό καρκίνωμα και σε καρκίνο του μαστού, ενώ πρόσφατα βρέθηκε μετάλλαξη που αναδιατάσσει το 3’ άκρο του γονιδίου σε καρκίνο πνεύμονα. Στις φυσιολογικές της λειτουργίες συμπεριλαμβάνεται συμμετοχή στην ενεργοποίηση Τ-λεμφοκυττάρων, αλλά και στην παραγωγή IL-2 από Τ-λεμφοκύτταρα. Aναστέλλει τη ρυθμιστική του κυτταρικού κύκλου πρωτεΐνη p27kip και κινητοποιεί διάφορους μεταγραφικούς παράγοντες που διεγείρουν την παραγωγή κυττοκινών όπως η IL-2 και ευοδώνουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Συμμετέχει ακόμη στην παραγωγή TNF-α από μακροφάγα, καθώς και στην διαβίβαση σημάτων που προέρχονται από την επίδραση TNF-α και CD40 σε μακροφάγα και Β-λεμφοκύτταρα. Η αναδιαταγμένη μορφή της φαίνεται πως είναι πολύ πιο δραστική. Αντίστοιχα, το γονίδιο που κωδικοποιεί το μεταγραφικό παράγοντα Gfi1 αποτελεί επίσης θέση ενσωμάτωσης προϊών σε MoMuLV-επαγόμενα Τ-λεμφώματα και προσδίδει μερική ανεξαρτησία από την ΙL-2 στις κυτταρικές σειρές που προέρχονται από αυτά. Σε διαγονιδιακά ποντίκια αναπτύσσονται Τ-λεμφώματα σε χαμηλό ποσοστό, το οποίο όμως αυξάνει κατά πολύ αν ταυτόχρονα εκφραστούν τα c-Myc ή Pim, ενώ υπερεκφράζεται και σε Β-λεμφώματα που αναπτύσσονται σε διαγονιδιακά Εmu-myc ποντίκια με την επίδραση MoMuLV.Ο ρόλος του στην ογκογένεση συνδέεται με την πρόοδο μάλλον παρά με την έναρξη της, ενώ κατέχει σημαντική θέση και στη ρύθμιση της αιμοποίησης. Στη ρύθμιση της έκφρασης του γονιδίου αυτού έχει δειχθεί ο επαγωγικός ρόλος της οδού ΕΡΚ, πιθανόν μέσω ενεργοποίησης του μεταγραφικού παράγοντα ΑΡ-1 ύστερα από TCR διέγερση. Στον άνθρωπο δεν έχει γίνει έως τώρα καμία μελέτη σχετικά με το ρόλο του στην ανάπτυξη αιματολογικών κακοηθειών, ως επίσης δεν έχει ποτέ μελετηθεί ταυτόχρονα με το γονίδιο Tpl2, το οποίο είναι γνωστό ότι διεγείρει την ΜΕΚ/ΕRΚ/ΑΡ-1 οδό. Τέλος, η κινάση Pim1 ανήκει, όπως και η MAP3K8, στις κυτταροπλασματικές κινάσες σερίνης/θρεονίνης και διαθέτει αντι-αποπτωτικές και επαγωγικές του κυτταρικού πολλαπλασιασμού ιδιότητες. Η ογκογόνος δράση της έχει επιβεβαιωθεί τόσο σε πειραματικά μοντέλα όσο και στον άνθρωπο, όπου έχει αποκαλυφθεί η συμμετοχή της σε Β-λεμφώματα, σε καρκίνο προστάτη και σε μυελοβλαστικές λευχαιμίες. Κατέχει σημαντικό ρόλο στην εκδήλωση της αντι-αποπτωτικής δράσης διάφορων κυττοκινών και ιδίως όσων ενεργοποιούν την STAT3. Θεωρείται ογκογονίδιο με ρόλο στη φάση της έναρξης της κακοήθους εξαλλαγής, κατά την πρόοδο της οποίας συνεργάζεται με άλλα ογκογονίδια. Οι Mikkers και συν χρησιμοποιώντας κατευθυνόμενη μεταλλαξιογένεση με MoMuLV σε ΕμMyc+/Pim1- ποντίκια προκειμένου να αναλύσουν τις περιοχές ενσωμάτωσης προϊών, ταυτοποίησαν εννέα περιοχές που σχετίζονται με σχέση αλληλοαποκλεισμού, δηλαδή μη ταυτόχρονης ενσωμάτωσης με το Pim1. Ανάμεσα σ’ αυτές περιλαμβανόταν το γονίδιο Tpl2 που σημαίνει ότι το Tpl2, όσον αφορά την ογκογένεση, πρέπει να δρα εν παραλλήλω ή σε κατώτερο επίπεδο από το Pim1. Στον άνθρωπο οι Β-λεμφοκυτταρικές κακοήθειες είναι κατά πολύ συχνότερες των Τ, τουλάχιστον στο Δυτικό κόσμο. Έτσι, στην παρούσα μελέτη συμπεριλάβαμε σειρά ασθενών με Τ και Β λεμφοειδείς νεοπλασίες (λευχαιμίες ή λεμφώματα με λευχαιμική έκφραση) με σκοπό να μελετήσουμε: α) την έκφραση των Tpl2, Gfi1 και Pim1 με ημι-ποσοτική, συμβατική RT-PCR, καθώς και με SybrGreen real-time qPCR σε λεμφομονοπύρηνα του περιφερικού αίματος των με σκοπό την ανάδειξη πιθανής υπερέκφρασης και των μεταξύ τους σχέσεων αποκλεισμού ή συνέργειας β) την πιθανότητα γονιδιακής ενίσχυσης του Tpl2 με multiplex PCR βάσει των αποτελεσμάτων των Σουρβίνος και συν σε καρκίνο του μαστού και γ) τα επίπεδα των TNF-α και IL-2 στον ορό με την ανοσοενζυματική μέθοδο ELISA, αλλά και τα επίπεδα των IL-12 και IFN-γ που συνδέονται με νόσους όπως οι LGL λευχαιμίες και η ΧΛΛ.Επιλέχθηκαν 24 ασθενείς της αιματολογικής κλινικής του Πανεπιστημιακού νοσοκομείου Ηρακλείου, 12 από τους οποίους έπασχαν από Β- και 12 από Τ- λεμφοκυτταρικές νεοπλασίες. Συμπεριελήφθη μία ασθενής με Β-λεμφοκυττάρωση που στη συνέχεια αποδείχθηκε αντιδραστικού τύπου από ρευματοειδή αρθρίτιδα, καθώς και 22 υγιείς μάρτυρες. Από κάθε ασθενή ή μάρτυρα ελήφθησαν 18 ml περιφερικού αίματος. Από το ίζημα των λεμφομονοπυρήνων που ελήφθη με τη μέθοδο της διαβαθμισμένης φυγοκέντρησης πάνω σε στοιβάδα φικόλης έγινε απομόνωση RNA και DNA, ενώ ο ορός των ασθενών χρησιμοποιήθηκε σε αντιδράσεις ELISA. Τα αποτελέσματα της συμβατικής RT-PCR είχαν χαμηλό δυναμικό εύρος στην εκτίμηση της σχετικής έκφρασης των γονιδίων, ωστόσο δε διέφεραν από τη real-time qPCR στην ανίχνευση των δειγμάτων με υπερέκφραση. Από τους ασθενείς με Τ-λεμφοκυτταρικές κακοήθειες 33% είχαν υπερέκφραση Tpl2, έως 5,2 φορές τη μέση τιμή των μαρτύρων και μάλιστα ήταν οι πάσχοντες από LGL-χρόνιες λεμφοκυτταρικές λευχαιμίες. Σε τρεις από αυτούς η νόσος συνοδεύονταν από ανοσολογικής αρχής ουδετεροπενία. Οι ίδιοι παρουσίαζαν και υπερέκφραση Gfi1. Υπερέκφραση Pim1 παρουσίασαν 6 από τους 12 ασθενείς (50%) και συγκεκριμένα η ομάδα των Τ-LGL καθώς και 3 ασθενείς με επιθετικού τύπου Τ-κακοήθειες. Από τους ασθενείς με Β-λεμφοκυτταρικές κακοήθειες υπερέκφραση Tpl2 παρουσίασαν 9 ασθενείς (75%) και ήταν όλοι οι ασθενείς με Β-χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία (ΧΛΛ) καθώς και μια ασθενής με λέμφωμα σπληνός της μεθοριακής ζώνης, ένας με λέμφωμα μανδύα και οριακά ο ασθενής με μετατροπή ΧΛΛ σε σύνδρομο Richter. Κανένας δεν παρουσίασε υπερέκφραση Gfi1. Εννιά επίσης ασθενείς με Β-λεμφοκυτταρικές κακοήθειες παρουσίασαν αυξημένη έκφραση του Pim1: οι ασθενείς με ΧΛΛ και οι ασθενείς με λέμφωμα τύπου μανδύα είχαν πολύ υψηλές τιμές καθώς και η ασθενής με λέμφωμα σπληνός της μεθοριακής ζώνης. Ενδιαφέροντα αποτελέσματα έδειξε η συσχέτιση των 3 γονιδίων με two-tailed Spearman’s rank order correlation ανάλυση. Έτσι αποδείχθηκε στατιστικά σημαντική θετική σχέση της έκφρασης και των τριών γονιδίων όσον αφορά τις Τ-λεμφοκυτταρικές κακοήθειες, ενώ στις Β- λεμφοκυτταρικές κακοήθειες θετικά σχετίζονταν μόνο η έκφραση των Τpl2 και Ρim1. Δεν αποδείχθηκε κάποια αρνητική σχέση μεταξύ των γονιδίων. Η ανάλυση του γονιδιακού φορτίου του Tpl2 με multiplex PCR σε γενωμικό DNA δεν έδειξε γονιδιακή ενίσχυση σε κανένα από τα δείγματα. Τέλος, η εκτίμηση των επιπέδων των IL-2, INF-γ, TNF-α και IL-12 στον ορό και η συσχέτισή τους με το Tpl2NORM έδωσε τα εξής αποτελέσματα: Η IL-2 είχε απροσδιόριστη τιμή σε όλα τα δείγματα. Οι ασθενείς με Τ-λεμφοκυτταρικές κακοήθειες γενικά και με LGL λευχαιμίες ειδικότερα είχαν στατιστικά υψηλότερες τιμές TNF-α σε σχέση με τους μάρτυρες, χωρίς στατιστικά σημαντική συσχέτιση TNF-α με Tpl2NORM, αλλά και υψηλότερες τιμές IL- 12 με θετική μάλιστα συσχέτιση μεταξύ Tpl2NORM και IL-12. Τα επίπεδα της INF-γ δε διέφεραν μεταξύ ασθενών και μαρτύρων, ωστόσο στην ομάδα των LGL παρατηρήθηκαν μεμονωμένα υψηλότατες τιμές. Παρόμοια και οι ασθενείς με Β- λεμφοκυτταρικές κακοήθειες είχαν υψηλότερες τιμές TNF-α από τους μάρτυρες, χωρίς να υπάρχει στατιστικά σημαντική συσχέτιση των τιμών TNF-α με τις τιμές Tpl2NORM. Από αυτούς, οι ασθενείς με λέμφωμα μανδύα παρουσίαζαν μεγαλύτερη τάση αύξησης των επιπέδων TNF-α σε σχέση με τους υπόλοιπους. Επιπλέον, οι ασθενείς με Β-λεμφοκυτταρικές κακοήθειες είχαν συνολικά υψηλότερες τιμές IL-12 αλλά και INF-γ από τους μάρτυρες χωρίς να ξεχωρίζει κάποια υπο- ομάδα νόσων, καθώς και θετική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης Tpl2 και των επιπέδων IL- 12. Συνοψίζοντας, δείχθηκε ότι οι χρόνιες λευχαιμίες των LGL κυττάρων παρουσιάζουν υπερέκφραση των ογκογονιδίων Tpl2, Gfi1 και Pim1. Έτσι, η προαναφερθείσα πιθανή σχέση αποκλεισμού μεταξύ των Tpl2 και Pim1 δεν φαίνεται να ισχύει, ενώ επιβεβαιώνεται η συνεργική σχέση των Pim1 και Gfi1. Ακόμη, η υπερέκφραση του mRNA του Tpl2 δεν οφείλεται σε γονιδιακή ενίσχυση, αντίθετα από την αντίστοιχη μελέτη στον καρκίνο του μαστού, πράγμα αναμενόμενο αφού στις λεμφοειδείς νεοπλασίες το φαινόμενο αυτό σπάνια ευθύνεται για την υπερέκφραση ογκογονιδίων. Για την παθογένεια των LGL λευχαιμιών λίγα είναι γνωστά. Πρόκειται για βραδείας εξέλιξης νεοπλασία των CD3 θετικών Τ/ΝΚ-like λεμφοκυττάρων, με συνήθη φαινότυπο CD8+, CD4–, TCR αβ+, CD16+, CD57+ ή των ΝΚ κυττάρων με φαινότυπο CD3-, TCR- , CD2+, CD16+, CD56+. Τα υπό μελέτη γονίδια έχουν πολλά επίπεδα δράσης που μπορούν να συμβάλλουν στην επαγωγή της ογκογένεσης στις παραπάνω νεοπλασίες. Έτσι, τα Tpl2 και Pim1 επάγουν την παραγωγή IL-2, ενώ τόσο αυτά όσο και το Gfi1 μετέχουν στις οδούς διέγερσης των Τ-λεμφοκυττάρων από την IL-2. Το Tpl2 ενδεχομένως εμπλέκεται, μέσω της ενεργοποίησης της JNK και στη διαφοροποίηση των Τ- λεμφοκυττάρων προς την κατεύθυνση των CD8, ύστερα από επίδραση TNF-α, όπως δείχθηκε στο πειραματικό μοντέλο ανάπτυξης φλεγμονώδους νόσου του εντέρου σε ΤnfΔARE ποντίκια. Τα αυξημένα επίπεδα IL-12 που βρέθηκαν στον ορό των ασθενών αυτών σχετίζονταν θετικά με την έκφραση του Tpl2, που είναι γνωστό ότι ενεργοποιεί την p38 οδό, ενώ οι ίδιοι ασθενείς είχαν και αυξημένα επίπεδα TNF-α. Έτσι, η ουδετεροπενία που παρουσιάζουν οι παραπάνω ασθενείς θα μπορούσε να οφείλεται στη αύξηση παραγωγής TNF-α από τα κύτταρα του κλώνου, με την επίδραση των IL-12 και IL-2 και τη διαμεσολάβηση του Tpl2 στην ενεργοποίηση των p38 και ERK οδών αντίστοιχα. Σε πλέον επιθετικές κακοήθειες των Τ-λεμφοκυττάρων, όπως η T- προλεμφοκυτταρική λευχαιμία, το περιφερικό Τ-λέμφωμα και το σύνδρομο Sezary σε προϊούσα φάση βρέθηκε υπερέκφραση μόνο του Pim1, στην ανάπτυξή των οποίων πιθανόν συνεργάζεται με άλλα ογκογονίδια. Στις Β-λεμφοειδείς νεοπλασίες που μελετήθηκαν παρατηρήθηκε αυξημένη έκφραση Tpl2 σε ασθενείς με Β-ΧΛΛ και σε δύο ασθενείς με λέμφωμα σπληνός της μεθοριακής ζώνης και λέμφωμα μανδύα αντίστοιχα. Στους ίδιους παρατηρήθηκε αυξημένη έκφραση και Pim1. Η συμμετοχή του Pim1 σε λεμφοειδείς νεοπλασίες και ιδίως Β- λεμφώματα στον άνθρωπο είναι ήδη γνωστή. Η μοριακή βιολογία της ΧΛΛ είναι ακόμα σε μεγάλο βαθμό άγνωστη. Αρκετές κυτταροκίνες έχουν αντι-αποπτωτική δράση στα κύτταρα της ΧΛΛ και παράγονται και αυτοκρινώς από τα λευχαιμικά κύτταρα. Επίσης, η υπερέκφραση NF-κΒ έχει κρίσιμο ρόλο στην επιβίωση των κυττάρων της ΧΛΛ, ενώ η αναστολή της ΜΑΡΚ οδού MKK3/6/p38 ελαττώνει την επιβίωση ΧΛΛ κυττάρων in vitro. Η έκφραση της κινάσης ΖΑΡ70, που μάλιστα προσδίδει κακή πρόγνωση, επάγεται μέσω Ras/ΜΑΡΚ σε φυσιολογικά Τ λεμφοκύτταρα, μολονότι ο μηχανισμός ενεργοποίησής της στα κύτταρα της ΧΛΛ δεν είναι ακόμα γνωστός. Τα παραπάνω προσφέρουν ένα πιθανό μηχανισμό συμμετοχής του Τpl2 στην ανάπτυξη της ΧΛΛ. Τα αυξημένα επίπεδα TNF-α, INF-γ και IL-12 που βρέθηκαν έχουν αντι-αποπτωτική δράση. Έτσι, το Tpl2 μπορεί να επάγει την ενεργοποίηση του μεταγραφικού παράγοντα NF-κΒ από διάφορες κυτταροκίνες ή μετά CD40 διέγερση. Ταυτόχρονα διεγείρει, μαζί με το Pim1 την παραγωγή IL-2 από τα λευχαιμικά κύτταρα δημιουργώντας ένα κύκλωμα θετικής ανάδρασης στην παραγωγή και δράση κυτταροκινών. Για το Gfi1 δε βρέθηκε συμμετοχή σε Β-λεμφοειδείς νεοπλασίες, εκτός από μια περίπτωση λεμφώματος σπληνός από κύτταρα της μεθοριακής ζώνης, γεγονός που συμφωνεί με αντίστοιχα πειραματικά δεδομένα. Τέλος, το λέμφωμα μανδύα, στο οποίο βρέθηκε συμμετοχή κυρίως του Pim1 και σε λιγότερο βαθμό του Tpl2, αποτελεί μια καλά μελετημένη πάθηση που χαρακτηρίζεται από την υπερέκφραση της κυκλίνης D1. Στο επιθετικό αυτό λέμφωμα έχει βρεθεί επιπλέον υπερέκφραση του NF-κΒ, ενώ σημαντική στην εξέλιξη της νόσου θεωρείται η αναστολή των ρυθμιστικών της G1 φάσης πρωτεϊνών p27kip ή p21 waf1. Για το Pim1 υπάρχουν ήδη δεδομένα σχετικά με το ρόλο του στη βλαστοειδή ποικιλία του λεμφώματος μανδύα, ενώ το Tpl2, με τις δράσεις που προαναφέρθηκαν (παραγωγή IL-2 και διέγερση NF-κΒ) και με την αναστολή της p27kip μπορεί να διαδραματίζει συνδυαστικό ρόλο στο λέμφωμα αυτό. Συμπερασματικά η υπερέκφραση των ογκογονιδίων Tpl2 και Gfi1 μπορεί να συμμετέχει στην ανάπτυξη ορισμένων T, Β, αλλά και ΝΚ λεμφοειδών νεοπλασιών, σε συνεργασία με άλλα ογκογονίδια όπως το Pim1, επιβεβαιώνοντας έτσι πειραματικά δεδομένα σε ζωικά μοντέλα και ιστικές καλλιέργειες σχετικά με το ρόλο τους στις λεμφοειδείς κακοήθειες. (EL)
Tpl2 and Gfi1 genes are considerably new members of the cell oncogene family for which we speculate a role in human cancer development as it is already understood that they contribute in the development of lymphoid neoplasms of T-cell origin mostly in animal experimental models. Specifically, Tpl2 kinase (or MAP3K8) induces T-lymphoblastic lymphoma growth when expressed in transgenic mice rearranged (truncated) at its C-terminus, while overexpression of the wild type protein is also oncogenic. In humans it has been implicated in Hodgkin’s lymphoma, in nasopharyngeal cancer and breast cancer. Recently a 3’ end mutation was discovered in lung cancer. Its normal function includes participation in Tlymphocyte activation and IL-2 production. It is inhibitory for the cell-cycle regulatory protein p27kip and induces various transcription factors that stimulate cytokine production like IL-2 and promote cell proliferation. Moreover it participates in TNF-α production from macrophages as well as TNF-α and CD40 signaling in macrophages and B-lymphocytes. The truncated kinase seems to be more potent. Accordingly, the gene that encodes for Gfi1 transcription factor is also a proviral integration site in MoMuLV-induced T-cell lymphomas and confers a partial IL-2 independence in the cell lines derived from these lymphomas. Transgenic mice develop Tcell lymphomas in a low rate which can be substantially increased by the simultaneous expression of c-Myc or Pim. It is also overexpressed in B-cell lymphomas induced by MoMuLV in Emu-myc mice. Its oncogenic potential is associated with progression rather than initiation of the process. It also plays an important role in hematopoiesis regulation. ERK pathway is important for Gfi1 regulation, possibly through the transcription factor AP-1 following TCR activation. Up to date there has been no study in humans addressing its role in hematologic neoplasms and no correlation with the Tpl2 gene which is a ΜΕΚ/ΕRΚ/ΑΡ-1 pathway mediator. Finally, Pim1 kinase belongs, like MAP3K8, in the cytoplasmic serine/threonine kinases and possesses anti-apoptotic and cell proliferation induction properties. Its oncogenic capacity has been confirmed in experimental models as well as in humans, where it has been implicated in B-cell lymphomas, prostate cancer and myeloblastic leukemias. It is important for the manifestation of the anti-apoptotic properties of various cytokines, especially those that activate STAT3. It is considered an oncogene with a role in the initiation of the malignant transformation during which it can co-operate with other oncogenes. Mikkers at al. used insertional mutagenesis with MoMuLV in ΕμMyc+/Pim1- mice in order to analyse proviral integration sites and they discovered 9 sites that are associated with mutual exclusion, in other words not co-current integration with Pim1. One of them was the Tpl2 gene which means that concerning oncogenesis Tpl2 should act parallel or downstream of Pim1. In humans the B-cell malignancies are far more frequent than the T-cell ones, at least in the Western world. Thus, in the present study we included a series of patients with T- and B-cell lymphoid neoplasms (leukemias or lymphomas with a leukemic presentation) aiming in studying: a) Tpl2, Gfi1 and Pim1 expression using semi-quantitative conventional RT-PCR as well as SybrGreen real-time qPCR in peripheral blood lymphomonocytes to explore the possibility of overexpression and to reveal co-operative or mutual exclusion relations b) the possibility of gene amplification of Tpl2 with multiplex PCR based on the results by Sourvinos at al. on human breast cancer and c) TNF-α and IL-2 serum levels by ELISA technique as well as IL-12 and INF-γ levels which are associated with diseases like the LGLleukemias and B-CLL. We selected 24 patients from the Hematology clinic of the University Hospital of Heraclion. Twelve suffered from B- and 12 from T-cell lymphoid malignancies. We also included a patient with B-cell lymphocytosis which proved to be of reactive type due to rheumatoid arthritis and 22 healthy volunteers. 18 ml of peripheral blood was drawn from each patient. RNA and DNA were isolated from the peripheral blood mononuclear fraction which was extracted by the ficol-gradient centrifugation method. Conventional RT- PCR results displayed a low dynamic range in the estimation of relative gene expression, although no different from real-time qPCR in distinguishing samples with overexpression. Among patients with T-cell lymphoid malignancies 33% had overexpression of Tpl2 up to 5.2 times of mean control expression and all of these were patients with LGL- chronic lymphocytic leukemias. Three of them had co-existent immune neutropenia. The same patients displayed Gfi1 overexpression. Pim1 overexpression was found in 6 out of 12 patients, specifically the T-LGL group plus 3 patients with aggressive T-cell malignancies. Among patients with B-cell lymphoid malignancies 9 (75%) showed Tpl2 overexpression. These were all the patients with B-CLL plus one patient with splenic lymphoma of marginal cell type, one patient with mantle cell lymphoma and marginally one patient with B-CLL/Richter’s transformation. None had Gfi1 overexpression. Moreover, 9 patients had Pim1 overexpression: the CLL patients and patients with mantle cell lymphoma, as well as the patient with lymphoma of marginal cell type. Two-tailed Spearman’s rank order correlation analysis showed interesting relations between the 3 genes: a statistically significant positive correlation of the expression of all three of them in T-cell malignancies and a Tpl2 - Pim1 expression positive correlation in Bcell malignancies. In each case there was no negative correlation between them. Tpl2 gene load analysis by multiplex PCR in genomic DNA showed no gene amplification in any sample. Finally, evaluation of IL-2, INF-γ, TNF-α and IL-12 serum levels and correlation with Tpl2NORM (e.g. Tpl2 expression) showed the following results: IL-2 was uncountable in all samples. Patients with T-cell lymphoid malignancies generally and specifically with LGL leukemias had statistically higher TNF-α levels than the control samples, without a statistically significant correlation between Tpl2NORM and TNF-α. They also had higher levels of IL-12 with a positive correlation between Tpl2NORM and IL-12. INF-γ levels were no different between patients and controls, although in the LGL group there were single cases with very high values. Likewise, patients with B-cell lymphoid malignancies had higher TNF-α than the controls without a statistically significant correlation between TNF-α and Tpl2NORM. Among those, patients with mantle cell lymphoma had a trend towards a higher TNF-α level than the rest. Moreover, patients with B-cell lymphoid malignancies had as a whole higher IL-12 and INF-γ levels compared to the controls with no distinguishable group. There was a positive correlation between Tpl2 expression and IL-12 levels. In summary, we showed that chronic leukemias of the LGL type show overexpression of Tpl2, Gfi1 and Pim1. Thus, the above mentioned mutual exclusion relationship between Tpl2 and Pim1 is not proven, while we confirm the co-operative relationship of Pim1 and Gfi1. Furthermore, Tpl2 mRNA overexpression is not due to gene amplification contrary to the corresponding breast cancer study, which is quite expectable, since this is a rare phenomenon in lymphoid neoplasms. Pathogenesis of the LGL malignancies is not very well understood. They are indolent neoplasms of the CD3 positive T/NK-like lymphocytes usually with a phenotype CD8+, CD4–, TCR αβ+, CD16+, CD57+ or of the NK cells with CD3-, TCR- , CD2+, CD16+, CD56+ phenotype. The genes in our study function in many levels that could promote oncogenesis in these neoplasms. Thus, Tpl2 and Pim1 induce IL-2 production, while the same genes as well as Gfi1 contribute in IL-2 induced T-lymphocyte activation. Tpl2 may be implicated though JNK activation in the Tcell differentiation towards CD8+ following TNF-α stimulation, as it was shown in the experimental model of inflammatory bowel disease in the ΤnfΔARE mice. High levels of IL-12 in these patients were positively correlated with Tpl2 expression which is a known p38 pathway activator, while the same patients had also high TNF-α levels. Thus, neutropenia in these patients could be a result of the increased TNF-α production by the malignant cells, resulting from IL-12 and IL-2 stimulation and mediated by p38 and ERK pathway activation by Tpl2 respectively. In the most aggressive malignancies of T-cells, like T-cell prolymphocytic leukemia, peripheral T-cell lymphoma and Sezary syndrome in progression we only found overexpression of Pim1, which apparently acts in concert with other genes in the malignant process. In the B-cell lymphoid malignancies that we studied we showed increased Tpl2 expression in patients with B-CLL and in two patients with splenic lymphoma of marginal cell type and mantle cell lymphoma respectively. In the same patients we observed Pim1 overexpression. Pim1 contribution to human lymphoid malignancies, especially B-cell lymphomas is well known. Molecular biology of B-CLL is a provocative issue, since it is still not thoroughly understood. Many cytokines have anti-apoptotic effect in CLL cells and can also be produced by them. Moreover, NF-κΒ overexpression has a critical role in CLL cell survival, while inhibition of MAPK pathway MKK3/6/p38 shortens their survival in vitro. ZAP70 kinase expression, which confers a bad prognosis, is induced though Ras/MAPK in the normal T lymphocytes, although we don’t know the mechanism of its activation in the CLL cells. All of the above offer us a possible mechanism of action for the Tpl2 kinase in CLL. Increased levels of TNF-α, INF-γ and IL-12 have an anti-apoptotic effect. Tpl2 can induce NF-κΒ activation by various cytokines or by CD40 activation. At the same time Tpl2 along with Pim1 can promote IL-2 production by the leukemic cell, thus creating a positive feedback circuit in cytokine production and activity. Gfi1 was not induced in B-cell malignancies, apart from a case of splenic lymphoma, which is in accordance with experimental data. Finally, mantle cell lymphoma, in which we basically found Pim1 and in a lesser degree Tpl2 overexpression, is a well studied disease which is characterized by cyclin D1 overexpression. Overexpression of NF-κΒ has also been shown in this aggressive lymphoma, while an important step in disease progression is the inhibition of the G1 regulatory proteins p27kip and p21 waf1. There is already data for a Pim1 role in the blastoid variant of the disease, while Tpl2, with its aforementioned activities (IL-2 production, NF-κΒ induction) and its inhibitory result on p27kip could play a combinational role in this lymphoma. In conclusion, Tpl2 and Gfi1 overexpression can contribute in the development of some human T, B and NK lymphoid neoplasms, in collaboration with other oncogenes like Pim1, thus confirming experimental results in animal models and cell cultures concerning their role in lymphoid malignancies. (EN)

Τύπος Εργασίας--Διδακτορικές διατριβές
text

Leukemia, Lymphocytic
Λεμφωματογένεση
Ιντερλευκίνη
Λευχαιμία, Λεμφοκυτταρική
Lymphoma
Oncogenes
Ογκογονίδια
Λέμφωμα

Πανεπιστήμιο Κρήτης (EL)
University of Crete (EN)

Greek

2007-07-26


Σχολή/Τμήμα--Ιατρική Σχολή--Τμήμα Ιατρικής--Διδακτορικές διατριβές



*Institutions are responsible for keeping their URLs functional (digital file, item page in repository site)