Ο νανοκινητήρας της έκκρισης πρωτεϊνών : μοριακός μηχανισμός

 
This item is provided by the institution :
University of Crete
Repository :
E-Locus Institutional Repository
see the original item page
in the repository's web site and access all digital files if the item*
share



PhD thesis (EN)

2013 (EN)
Molecular function of the preprotein secretion nanomachine
Ο νανοκινητήρας της έκκρισης πρωτεϊνών : μοριακός μηχανισμός

Σαρδής, Μάριος-Φραντζέσκος

Οικονόμου, Αναστάσιος

Περίπου το 1/3 των πρωτεϊνών που παράγονται στο κυτταρόπλασμα ενός βακτηριακού κυττάρου, έχουν ως τελικό προορισμό εξωκυτταροπλασματικά διαμερίσματα. Ωστόσο, η κυτταροπλασματική μεμβράνη αποτελεί ένα αδιαπέραστο φράγμα, που συγκρατεί τα μακρομόρια της ζωής διαμερισματοποιημένα. Η διαπεραίωση των πρωτεϊνών μέσω της κυτταροπλασματικής μεμβράνης δεν είναι θερμοδυναμικά αυθόρμητη διαδικασία. Για να μπορούν να υλοποιούν αυτή την διαδικασία τα κύτταρα έχουν αναπτύξει τουλάχιστον 16 εκκριτικά συστήματα. Από αυτά το Sec σύστημα, το επίκεντρο αυτής της μελέτης, είναι το μοναδικό που βρίσκεται σε όλα τα κύτταρα των ζωντανών οργανισμών και είναι απαραίτητο για την ζωή. Στα βακτήρια το σύστημα Sec αποτελείται από το διαμεμβρανικό σύμπλοκο SecY, SecE, SecG (SecYEG), που δημιουργεί τον δίαυλο μέσω του οποίου εξέρχονται οι πρωτεΐνες, και τον κυτταροπλασματικό κινητήρα SecA. Οι πρωτεΐνες που προορίζονται για τον χώρο πέρα από την κυτταροπλασματική μεμβράνη, συντίθενται σαν προπρωτεΐνες και διαθέτουν μια μικρή (20-30αα) αμινοτελική αμινοξική αλληλουχία που αποκαλείται πεπτίδιο σήμα και αποκόπτεται μετά την ολοκλήρωση της μετατόπισης τους μέσω του συμπλόκου SecA-SecYEG. Το υπόλοιπο τμήμα της προπρωτεΐνης αποκαλείται ώριμο τμήμα. Η SecA αλληλεπιδρά με τις προπρωτεΐνες στο κυτταρόπλασμα ή αφού έχει προηγουμένως σχηματίσει σύμπλοκο με την SecYEG στην μεμβράνη. Στην συνέχεια η SecA καταναλώνει ενέργεια (με την μορφή ΑΤΡ) για να παράγει το απαραίτητο μηχανικό έργο που χρειάζεται για την ώθηση των προπρωτεϊνών μέσω της SecYEG. Μετά από μερικούς κύκλους υδρόλυσης ΑΤΡ το πεπτίδιο σήμα αποκόπτεται και η πρωτεΐνη πλέον, απελευθερώνεται στον κυτταροπλασματικό χώρο όπου και παραμένει ή μετακινείται περαιτέρω με την βοήθεια άλλων συστημάτων. Στόχος της συγκεκριμένης εργασίας ήταν ο προσδιορισμός της περιοχής της SecA με την οποία αλληλεπιδρούν οι προπρωτεΐνες και του μηχανισμού με το οποίο αυτή η αλληλεπίδραση ενεργοποιεί την υδρόλυση του ΑΤΡ και την παραγωγή μηχανικού έργου έκκρισης. Τα αποτελέσματα της μελέτης μας δείχνουν ότι οι προπρωτεΐνες αλληλεπιδρούν με την ρηχή κυτταροπλασματική επιφάνεια της SecA, όταν αυτή βρίσκεται σε σύμπλοκο με την SecYEG. Τα πεπτίδια σήματα και τα ώριμα τμήματα των προπρωτεϊνών έχουν ανεξάρτητες θέσεις πρόσδεσης πάνω στην SecA. Η θέση πρόσδεσης του ώριμου τμήματος βρίσκεται στην κυτταροπλασματική επιφάνεια που σχηματίζεται από τις 4 περιοχές της SecA, την περιοχή πρόσδεσης του νουκλεοτιδίου (NBD, Nucleotide Binding Domain), την περιοχή ενδομοριακής ρύθμισης της υδρόλυσης του ΑΤΡ-2 (IRA2, Intramolecular Regulator of ATP-hydrolysis 2) την περιοχή πρόσδεσης των προπρωτεϊνών (PBD, Preprotein Binding Domain) και την καρβοξυτελική περιοχή (C-domain). Η θέση αλληλεπίδρασης των πεπτιδίων σημάτων βρίσκεται σε μια ρηχή κοιλότητα που σχηματίζεται κατά μήκος της PBD. Το ώριμο τμήμα ενδέχεται να αλληλεπιδρά πρώτο με την SecΑ, καθώς στις περισσότερες προπρωτεΐνες έχει πολύ μεγαλύτερο μέγεθος από ο πεπτίδιο σήμα, γεγονός που καθιστά την στοχαστική πρόσδεση του πιο πιθανή. Η PBD περιστρέφεται και φέρνει τις δυο ανεξάρτητες θέσεις πρόσδεσης στον κατάλληλο προσανατολισμό για να επιτευχθεί βέλτιστη συνεργατική αλληλεπίδραση της προπρωτεΐνης (πεπτίδιο σήμα και ώριμο τμήμα) με την SecA. Η αρχική αλληλεπίδραση των προπρωτεϊνών με το σύμπλοκο SecA-SecYEG, επάγει την μετάδοση ενός σήματος ενεργοποίησης, που τελικά οδηγεί στην παραγωγή μηχανικού έργου μετακίνησης της προπρωτεΐνης. Η μετάδοση αυτού του σήματος γίνεται μέσω μιας αλληλουχίας δομικών μεταβολών κατά μήκος της SecA. Αρκετά επιφανειακά αμινοξικά κατάλοιπα στην PBD συμμετέχουν σε αυτή την ενεργοποίηση, μέσω της αλληλεπίδρασής τους με το SecYEG και άλλες πρωτεΐνες. Επιπλέον, η θέση της PBD φαίνεται πως ρυθμίζει την ενεργοποίησης του ολοενζύμου SecA-SecYEG. Ωστόσο, η περιστροφική κίνηση της PBD δεν είναι το μηχανικό γεγονός που οδηγεί στην ώθηση των προπρωτεϊνών μέσω του SecYEG. Ένας επιπλέον μηχανισμός που χρησιμοποιεί η SecA για να ελέγχει την ενεργοποίηση της είναι η μεταβολή της ολιγομερικής της κατάστασης. Η SecA αρχικά αλληλεπιδρά με την SecYEG και τις προπρωτεΐνες και ενεργοποιείται από αυτές σαν διμερές. Ωστόσο, στην συνέχεια η SecA πρέπει να μονομεριστεί για να ολοκληρωθεί η παγίδευση και η μετατόπιση της προπρωτεΐνης μέσω του διαύλου που σχηματίζει η SecYEG. (EL)
About 1/3 of the proteins produced in the cytoplasm of bacteria need to be translocated to extracytoplasmic locations. The cytoplasmic membrane is an impenetrable barrier that holds life’s macromolecules compartmentalized. Protein crossing of the membrane hydrophobic bilayer is thermodynamically unfavorable and does not occur spontaneously. To tackle this challenge, cells have evolved at least 16 systems to translocate proteins into and across the cytoplasmic membrane. One of these, the Sec system is the only ubiquitous and essential for viability. In bacteria the Sec system consists of the SecY/SecE/SecG (SecYEG hereafter) membrane-embedded heterotrimeric complex, which forms the channel through which proteins are threaded, and the cytoplasmic motor SecA. Proteins destined to be translocated outside the cytoplasmic membrane are produced as preproteins, bearing short and conserved aminoterminal extensions called signal peptides and mature domains, that are not conserved in their length or physicochemical properties. Signal peptides are cleaved once the translocation of the preprotein is almost completed. SecA interacts with preproteins in the cytoplasm or after it has formed a complex with SecYEG at the membrane. Next SecA consumes energy in the form of ATP, to produce mechanical work that somehow pushes and threads preproteins through the SecYEG pore. After a few cycles of ATP hydrolysis (depending on the size of the preproteins) the signal peptide is cleaved and the mature domain is released in the periplasmic space for further processing. The aim of this study was to determine the region on the translocase holoenzyme (SecA-SecYEG) where preproteins dock for the first time. We also wanted to determine which are the molecular/structural events that lead to the activation of the translocase in response to preprotein binding. Our results show that preproteins interact with the flat cytoplasmic surface of SecA, when in complex with SecYEG. Signal peptides and mature domains utilize independent binding sites on SecA; mature domains bind on the flat surface formed by all 4 domains of SecA(NBD, Nucleotide Binding Domain, IRA2, Intramolecular Regulator of ATP-hydrolysis 2, PBD, Preprotein Binding Domain and the C-domain); and signal peptides bind on a shallow groove along PBD. Mature domains might interact first with SecA due to their sheer size (in relation to the signal peptide) making their stochastic binding more probable. PBD rotates to adjust the spacing between the two independent binding sites in order to ensure optimal synergistic preprotein binding (signal peptide and mature domain binding). The initial interaction of preproteins with the SecA-SecYEG complex induces the transmition of an activation signal that leads to the production of preprotein translocation mechanical work. The transmition of the activation signal occurs through structural alterations that occur throughout SecA. Amino acids on the surface of PBD participate in the transduction of the activation signal through interactions with SecYEG and other proteinaceous moieties. Furthermore, PBD position seems to affect the activation of SecA. However, PBD swiveling is not the mechanical event that pushes preproteins through SecYEG. An additional mechanism SecA uses to control its activation is its oligomerization during preprotein secretion. SecA interacts with SecYEG and preproteins and gets activated as a dimer. However, SecA must monomerize to proceed to the later steps of the reactions and complete the threading of the preprotein through the SecYEG pore. (EN)

Τύπος Εργασίας--Διδακτορικές διατριβές
text

Preproteins
Μεμβράνη
Έκκριση
Secretion
Προπρωτεΐνες
Νανοκινητήρας
Seca
Membrane
Secyeg
Nanomachine

Πανεπιστήμιο Κρήτης (EL)
University of Crete (EN)

Greek

2013-11-07


Σχολή/Τμήμα--Σχολή Θετικών και Τεχνολογικών Επιστημών--Τμήμα Βιολογίας--Διδακτορικές διατριβές



*Institutions are responsible for keeping their URLs functional (digital file, item page in repository site)