Δημιουργία πλασμιδιακής κατασκευής για τη στοχευμένη απενεργοποίηση του γονιδίου Fra10Ac1 στο ποντίκι

 
This item is provided by the institution :
University of Crete
Repository :
E-Locus Institutional Repository
see the original item page
in the repository's web site and access all digital files if the item*
share




2005 (EN)
Δημιουργία πλασμιδιακής κατασκευής για τη στοχευμένη απενεργοποίηση του γονιδίου Fra10Ac1 στο ποντίκι

Αποστολοπούλου, Δέσποινα

Στα πλαίσια της προσπάθειας του εργαστηρίου μας για τη λειτουργική ανάλυση γονιδίων που χαρτογραφούνται στο χρωμόσωμα 10 του ανθρώπου και σχετίζονται με κλινικούς φαινοτύπους μελετήσαμε το γονίδιο FRA10AC1, που χαρτογραφείται στην εύθραυστη χρωμοσωμική θέση FRA10Α (10q23.3-q24.2). Η FRA10A ανήκει στις σπάνιες ευαίσθητες στο φυλλικό οξύ εύθραυστες θέσεις και συγκεκριμένα είναι η πιο συχνά εμφανιζόμενη σπάνια εύθραυστη αυτοσωμική θέση. Με βάση πρόσφατα αποτελέσματα της ομάδας μας, διαπιστώθηκε ότι η εκδήλωση της FRA10A σχετίζεται άμεσα με την επέκταση και την υπερμεθυλίωση μιας τρινουκλεοτιδικής επανάληψης CGG στο 5 UTR του γονιδίου FRA10AC1. Η εμφάνιση της FRA10A έχει συσχετιστεί με διανοητική καθυστέρηση. Η παρούσα εργασία συμβάλει στην ανάπτυξη ενός ζωικού μοντέλου της ασθένειας στο ποντίκι, στο οποίο το ένα ή και τα δύο αλληλόμορφα του Fra10Ac1 θα έχουν απενεργοποιηθεί. Αυτό θα επιτρέψει τη λεπτομερέστερη περιγραφή του φαινοτύπου της μερικής ή ολικής απώλειας της έκφρασης του FRA10AC1. Το γονιδίο Fra10Ac1 είναι μοναδιαίο στο γονιδίωμα του ποντικού. Επομένως, η απενεργοποίησή του με ομόλογο ανασυνδυασμό θα συμβάλει σημαντικά στη μελέτη της λειτουργίας του. Σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η διερεύνηση γονιδιωματικής βιβλιοθήκης ποντικού στελέχους 129SV για την απομόνωση γενωμικών κλώνων που θα χρησιμοποιηθούν για την απενεργοποίηση του ενδογενούς γονιδίου, ο σχεδιασμός της τελικής κατασκευής-στόχου και των ενδιάμεσων κατασκευών που απαιτούνται για την επίτευξή της καθώς και η δημιουργία αυτών. Για τη διερεύνηση της βιβλιοθήκης χρησιμοποιήθηκαν τρεις διαφορετικοί ραδιοσημασμένοι ανιχνευτές που παρασκευάστηκαν από γενωμικό DNA ή cDNA του Fra10Ac1 του ποντικού. Κάθε πείραμα διερεύνησης πραγματοποιήθηκε σε ~3x105 κλώνους. Συνολικά απομονώθηκαν έξι διαφορετικοί μοναδιαίοι κλώνοι, που εκτείνονται από το εξόνιο 1 μέχρι και το εξόνιο 11 του γονιδίου. Ο έλεγχος της ακεραιότητας των κλώνων και η χαρτογράφησή τους στη γενωμική αλληλουχία έγιναν, είτε τεμαχίζοντάς τους με περιοριστικά ένζυμα που αναγνωρίζουν θέσεις στη γενωμική αλληλουχία, είτε πραγματοποιώντας PCR με εκκινητές που υβριδοποιούνται στην αλληλουχία αυτή. Από τους κλώνους αυτούς επιλέχθηκε αυτός που περιείχε τα πρώτα εξόνια του γονιδίου και βάσει αυτού σχεδιάστηκαν η τελική κατασκευή-στόχος, καθώς και οι ενδιάμεσες κατασκευές. Τελικά δημιουργήθηκαν τέσσερις ενδιάμεσες κατασκευές, οι οποίες ελέγχθηκαν με ενζυμικό τεμαχισμό καθώς και με αλληλούχηση. Η ανάπτυξη μοντέλου ποντικού Fra10Ac1-/- μπορεί να αντισταθμίσει την απουσία ομόζυγων ατόμων με FRA10A στον άνθρωπο. Η λεπτομερής ανάλυση του φαινοτύπου των ζώων Fra10Ac1-/- και Fra10Ac1+/-, τα οποία μιμούνται αντίστοιχα την ολική ή μερική έλλειψη της πρωτεΐνης Fra10Ac1 πρέπει να περιλαμβάνει μελέτες της ιστολογίας του εγκεφάλου και της συμπεριφοράς των ζώων αυτών καθώς και έλεγχο για πιθανές νοητικές δυσλειτουργίες. Έτσι, το μοντέλο αυτό θα συμβάλλει στη συσχέτιση της λειτουργίας του FRA10AC1 με το φαινότυπο της FRA10A. (EL)
During our team's effort to functionally characterize human chromosome 10 genes which have been associated with clinical phenotypes, we studied FRA10AC1 gene, located at FRA10A fragile site (10q23.3-q24.2). This site belongs to rare folate sensitive fragile sites and is the most frequent among autosomal rare fragile sites. Recently, we found out that FRA10A expression is directly linked to the extension and hypermethylation of a trinucleotide CGG repeat lying at the 5 UTR of FRA10AC1 gene. FRA10A expression has been associated with mental retardation. This work contributes to the generation of a mouse model, in which one or both Fra10Ac1 alleles will be inactivated. This will allow the detailed description of partial or total FRA10AC1 loss of function phenotype. Fra10Ac1 is unique in mouse genome. Thus, its inactivation by homologous recombination will contribute to its functional analysis. This work aims at the screening of mouse strain 129SV genomic library for the isolation of genomic clones that will be used for the inactivation of the endogenous gene, the designing of the final target construct and that of the necessary intermediate constructs, as well as their construction. Three different radiolabeled probes from genomic or Fra10Ac1 cDNA were used for the library screening. Each screening was performed on ~3x105 clones. Totally, six different unique clones, extending from exon 1 to exon 11, were isolated. Their integrity control and their mapping on the genomic sequence were obtained either by restriction analysis or PCR. One of these clones, containing the first exons of the gene, was selected for the designing of the intermediate and the final constructs. Finally, four intermediate constructs were generated and tested by restriction analysis and DNA sequencing. The generation of Fra10Ac1-/- mouse model can compensate for the absence of FRA10A homozygotes in humans. The detailed phenotype analysis of Fra10Ac1-/- and Fra10Ac1+/- animals, which mimic the total or partial Fra10Ac1 protein loss, respectively, must include brain histology studies and behavioral tests, as well as examination for mental abnormalities. Therefore, this model will contribute to the correlation of FRA10AC1 function with the FRA10A phenotype. (EN)

text
Τύπος Εργασίας--Μεταπτυχιακές εργασίες ειδίκευσης

Πανεπιστήμιο Κρήτης (EL)
University of Crete (EN)

Greek

2005-11-28


Σχολή/Τμήμα--Σχολή Θετικών και Τεχνολογικών Επιστημών--Τμήμα Βιολογίας--Μεταπτυχιακές εργασίες ειδίκευσης



*Institutions are responsible for keeping their URLs functional (digital file, item page in repository site)