{ "@graph" : [ { "@id" : "http://semantics.gr/authorities/EKT-voc-classifier/1949252375", "@type" : "skos:Concept", "broader" : "http://semantics.gr/authorities/EKT-voc-classifier/73942790", "exactMatch" : [ "http://semantics.gr/authorities/Frascati/Industrial-biotechnology", "http://semantics.gr/authorities/EKT-voc/1949252375" ], "narrowMatch" : "http://semantics.gr/authorities/EKT-voc/47132127", "narrower" : [ "http://semantics.gr/authorities/EKT-voc-classifier/786006816", "http://semantics.gr/authorities/EKT-voc-classifier/1465183072", "http://semantics.gr/authorities/EKT-voc-classifier/882044792" ], "note" : { "@language" : "en", "@value" : "Frascati 42" }, "prefLabel" : [ { "@language" : "en", "@value" : "Industrial Biotechnology" }, { "@language" : "el", "@value" : "Βιομηχανική Βιοτεχνολογία" } ], "relatedMatch" : [ "http://vocabularies.unesco.org/thesaurus/concept619", "http://id.loc.gov/authorities/subjects/sh85014263", "http://id.loc.gov/authorities/subjects/sh85065899" ] }, { "@id" : "http://semantics.gr/authorities/openarchives-item-types/ptyxiakh-ergasia", "@type" : "skos:Concept", "broadMatch" : "http://vocab.getty.edu/aat/300028029", "broader" : "http://semantics.gr/authorities/openarchives-item-types/Research-Paper-", "prefLabel" : [ { "@language" : "en", "@value" : "Bachelor thesis" }, { "@language" : "el", "@value" : "Πτυχιακή εργασία" } ] }, { "@id" : "https://www.openarchives.gr/aggregator-openarchives/edm/aggregation/provider/000011-123456789_42887%231", "@type" : "ore:Aggregation", "aggregatedCHO" : "https://www.openarchives.gr/aggregator-openarchives/edm/ntua/000011-123456789_42887", "dataProvider" : "Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο", "isShownAt" : "https://dspace.lib.ntua.gr/xmlui/handle/123456789/42887", "provider" : "Greek Aggregator OpenArchives.gr | National Documentation Centre (EKT)", "rights" : "other" }, { "@id" : "https://www.openarchives.gr/aggregator-openarchives/edm/ntua/000011-123456789_42887", "@type" : "edm:ProvidedCHO", "contributor" : [ { "@language" : "el", "@value" : "Τσουκιάς, Νικόλαος" }, { "@language" : "el", "@value" : "ntua" }, { "@language" : "el", "@value" : "Τόπακας, Ευάγγελος" }, { "@language" : "el", "@value" : "Κέκος, Δημήτριος" } ], "creator" : [ { "@language" : "el", "@value" : "Καραγιαννάκη, Ιωάννα" }, { "@language" : "en", "@value" : "Karagiannaki, Ioanna" } ], "description" : [ { "@language" : "en", "@value" : "The purpose of the present diploma thesis is the isolation of a gene (MtOx60685) from \nthe ascomycete \nMyceliophtora thermophila\nwhich encodes a catechol oxidase, the \nexpression of this protein in the yeast \nPichia Pastoris\nand the biochemical \ncharacterizatio\nn of the produced enzyme.\nAs the gene was isolated using the polymerase chain reaction (PCR) from the genomic \nDNA of the fungus which contained an intron, the in vitro splicing with the method of \nOverlapping Extension PCR followed, during which the amplifi\ncation of the two coding \nregions in the gene was performed. The overlap / extension polymerase chain reaction \nmethod was used in the production of DNA fragments derived from the junction of these \ntwo regions. The desired sequence was isolated and inserted \ninto the pPICZ\nα\nA vector \nand after linearization of the recombinant plasmid, the procedure of transformation of the \ncells of the yeast \nP. pastoris\nby electroporation took place.\nThe expression of the recombinant protein from the transformed colonies was stu\ndied in \nthe extracellular space, showing the maximum activity of the culture on day 4, using \ncatechin as substrate. Additionally, a study was also conducted in order to optimize the \ncopper concentration of the cultures, where the maximum activity occurs on\ncopper \nconcentration of 25 μM.\nThe result of the purification was evaluated using polyacrylamide gel electrophoresis \nrevealing more than one bands. The band that appeared at 47 kDa belongs to \nMtOx60685, while the rest bands correspond to different glycosy\nlations of the protein.\nIn order to determine the enzyme activity, assays were performed on various substrates. \nOut of these substrates, the maximum activity was observed qualitatively in 4\n-\nchlorocatechol, while activity in general was observed over a wide\nrange of substrates, \nsuch as catechin, epicatechin, guaiacol and L\n-\ntyrosine after adding L\n-\ndopamine. Since \nthe activity in mono\n-\nphenolic\nsubstrates was minimal\n, the recombinant enzyme was \ncharacterized as catechol oxidase.\nThe optimal temperature of act\nion was calculated at 65 °C and the optimal pH of action \n7.5 in 4\n-\nchlorocatechol. With respect to the thermal stability of the enzyme it was \n7\nobserved that the protein is sufficiently thermostable at 40 °C (more than 90% after 24 h) \nand after incubation at\n50 °C for one day it loses 60% of its activity. After incubation at 60 \n° C the protein loses about 75% of its activity in 5 h, while at 70 °C after the first half hour \n90% of its activity is lost" }, { "@language" : "el", "@value" : "Σκοπός της παρούσας διπλωματικής εργασίας ήταν η απομόνωση ενός γονιδίου (MtOx60685) του ασκομύκητα Myceliophtora thermophila που κωδικοποιεί μία κατεχολοξειδάση, η έκφραση του στη ζύμη Pichia Pastoris, καθώς και ο βιοχημικός χαρακτηρισμός του παραγόμενου ενζύμου. Καθώς το γονίδιο που απομονώθηκε μέσω της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) από το γενωμικό DNA του μύκητα περιείχε ένα εσώνιο, ακολούθησε in vitro μάτισμα του με τη μέθοδο της Splicing by Overlapping Extension PCR, όπου πραγματοποιήθηκε ενίσχυση των δύο κωδικοποιουσών περιοχών το γονιδίου. Μέσω της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης επικάλυψης/επέκτασης πραγματοποιήθηκε παραγωγή τμημάτων DNA που προέρχονταν από τη συνένωση των δύο αυτών περιοχών. Έπειτα, η επιθυμητή αλληλουχία απομονώθηκε και εισήχθη στον πλασμιδιακό φορέα pPICZαΑ και μετά τη γραμμικοποίηση του, ακολούθησε μετασχηματισμός κυττάρων του ζυμομύκητα P. pastoris με ηλεκτροδιάτρηση. Η έκφραση της ανασυνδυασμένης πρωτεϊνης από τα μετασχηματισμένα στελέχη μελετήθηκε στον εξωκυτταρικό χώρο, παρουσιάζοντας τη μέγιστη ενεργότητα την 4η μέρα καλλιέργειας σε υπόστρωμα κατεχίνης. Επιπλέον, πραγματοποιήθηκε μελέτη για τη βελτιστοποίηση των καλλιεργειών ως προς τη συγκέντρωση χαλκού, με μέγιστη ενεργότητα να παρουσιάζεται για συγκέντρωση χαλκού 25 μM. \nΜετά τον καθαρισμό του ενζύμου, πραγματοποιήθηκε ηλεκτροφόρηση σε πήκτη πολυακρυλαμιδίου, όπου εμφανίστηκαν παραπάνω από μία ζώνες. Η ζώνη που εμφανίστηκε στα 47 kDa ανήκει στην MtOx60685, ενώ οι παραπάνω ζώνες θεωρείται ότι αντιστοιχούν σε διαφορετικές γλυκοζυλιώσεις της πρωτεϊνης. \nΜε σκοπό την εύρεση της δράσης του ενζύμου πραγματοποιήθηκαν δοκιμές σε διάφορα υποστρώματα. Από τα υποστρώματα αυτά, μέγιστη ενεργότητα παρατηρήθηκε ποιοτικά στο υπόστρωμα 4-χλωροκατεχόλη, ενώ παρατηρήθηκε δράση σε ένα μεγάλο εύρος υποστρωμάτων, όπως στην κατεχίνη, στην επικατεχίνη, στη γουαιακόλη και στη L- τυροσίνη μετά από προσθήκη L- ντοπαμίνης. Εφόσον η ενεργότητα του ενζύμου σε μονοφαινολικά υποστρώματα ήταν μηδαμινή, το ανασυνδυασμένο ένζυμο χαρακτηρίστηκε ως κατεχολοξειδάση. \nΌσον αφορά τον χαρακτηρισμό του ανασυνδυασμένου ενζύμου, η βέλτιστη θερμοκρασία υπόλογίστηκε στους 65 οC και βέλτιστο pH δράσης το 7.5 σε υπόστρωμα 4- χλωροκατεχόλη. Αναφορικά με τη θερμική σταθερότητα του ενζύμου, παρατηρήθηκε ότι η πρωτεϊνη είναι αρκετά θερμοσταθερή στους 40 οC (πάνω από 90% μετά από 24 h) ενώ ύστερα από επώαση στους 50 οC για μία ημέρα χάνει 60% της ενεργότητάς του. Μετά από επώαση στους 60 οC η πρωτεϊνη χάνει περίπου το 75% της ενεργότητας μετά το πέρας των 5 h, ενώ στους 70 οC από τη πρώτη μισή ωρά χάνεται το 90% της ενεργότητας." } ], "identifier" : [ "http://dspace.lib.ntua.gr/xmlui/handle/123456789/42887", "http://dx.doi.org/10.26240/heal.ntua.12240" ], "language" : "gre", "dc:rights" : "Default License", "subject" : [ { "@language" : "en", "@value" : "Heterologous expression" }, { "@language" : "en", "@value" : "Biotechnology" }, { "@language" : "el", "@value" : "Myceliophthora thermophila" }, { "@id" : "http://semantics.gr/authorities/EKT-voc-classifier/1949252375" }, { "@language" : "en", "@value" : "Cloning" }, { "@language" : "en", "@value" : "Characterisation" }, { "@language" : "el", "@value" : "Χαρακτηρισμός" }, { "@language" : "el", "@value" : "Κλωνοποίηση" }, { "@language" : "el", "@value" : "Ετερόλη έκφραση" }, { "@language" : "el", "@value" : "Βιοτεχνολογία" }, { "@language" : "en", "@value" : "Catechol-oxidase" } ], "title" : { "@language" : "el", "@value" : "Eτερόλογη έκφραση και χαρακτηρισμός μιας κατεχολ-οξειδασης από το θερμόφιλο μύκητα Myceliophthora thermophila" }, "type" : [ "bachelorThesis", { "@id" : "http://semantics.gr/authorities/openarchives-item-types/ptyxiakh-ergasia" } ], "created" : "2016-02-22" } ], "@context" : { "narrower" : { "@id" : "http://www.w3.org/2004/02/skos/core#narrower", "@type" : "@id" }, "prefLabel" : { "@id" : "http://www.w3.org/2004/02/skos/core#prefLabel" }, "note" : { "@id" : "http://www.w3.org/2004/02/skos/core#note" }, "relatedMatch" : { "@id" : "http://www.w3.org/2004/02/skos/core#relatedMatch", "@type" : "@id" }, "exactMatch" : { "@id" : "http://www.w3.org/2004/02/skos/core#exactMatch", "@type" : "@id" }, "broader" : { "@id" : "http://www.w3.org/2004/02/skos/core#broader", "@type" : "@id" }, "narrowMatch" : { "@id" : "http://www.w3.org/2004/02/skos/core#narrowMatch", "@type" : "@id" }, "broadMatch" : { "@id" : "http://www.w3.org/2004/02/skos/core#broadMatch", "@type" : "@id" }, "rights" : { "@id" : "http://www.europeana.eu/schemas/edm/rights" }, "provider" : { "@id" : "http://www.europeana.eu/schemas/edm/provider" }, "isShownAt" : { "@id" : "http://www.europeana.eu/schemas/edm/isShownAt", "@type" : "@id" }, "dataProvider" : { "@id" : "http://www.europeana.eu/schemas/edm/dataProvider" }, "aggregatedCHO" : { "@id" : "http://www.europeana.eu/schemas/edm/aggregatedCHO", "@type" : "@id" }, "created" : { "@id" : "http://purl.org/dc/terms/created" }, "subject" : { "@id" : "http://purl.org/dc/elements/1.1/subject" }, "identifier" : { "@id" : "http://purl.org/dc/elements/1.1/identifier" }, "type" : { "@id" : "http://purl.org/dc/elements/1.1/type" }, "title" : { "@id" : "http://purl.org/dc/elements/1.1/title" }, "contributor" : { "@id" : "http://purl.org/dc/elements/1.1/contributor" }, "description" : { "@id" : "http://purl.org/dc/elements/1.1/description" }, "creator" : { "@id" : "http://purl.org/dc/elements/1.1/creator" }, "language" : { "@id" : "http://purl.org/dc/elements/1.1/language" }, "ore" : "http://www.openarchives.org/ore/terms/", "owl" : "http://www.w3.org/2002/07/owl#", "svcs" : "http://rdfs.org/sioc/services#", "skos" : "http://www.w3.org/2004/02/skos/core#", "rdfs" : "http://www.w3.org/2000/01/rdf-schema#", "rdaGr2" : "http://rdvocab.info/ElementsGr2/", "edm" : "http://www.europeana.eu/schemas/edm/", "ekt" : "https://www.semantics.gr/authorities/schemanamespaces/ekt#", "doap" : "http://usefulinc.com/ns/doap#", "rdf" : "http://www.w3.org/1999/02/22-rdf-syntax-ns#", "xalan" : "http://xml.apache.org/xalan", "dcterms" : "http://purl.org/dc/terms/", "wgs84_pos" : "http://www.w3.org/2003/01/geo/wgs84_pos#", "foaf" : "http://xmlns.com/foaf/0.1/", "crm" : "http://www.cidoc-crm.org/rdfs/cidoc_crm_v5.0.2_english_label.rdfs#", "dc" : "http://purl.org/dc/elements/1.1/" } }