ntuaΤσουκιάς, ΝικόλαοςΤόπακας, ΕυάγγελοςΚέκος, ΔημήτριοςΚαραγιαννάκη, ΙωάνναKaragiannaki, IoannaΣκοπός της παρούσας διπλωματικής εργασίας ήταν η απομόνωση ενός γονιδίου (MtOx60685) του ασκομύκητα Myceliophtora thermophila που κωδικοποιεί μία κατεχολοξειδάση, η έκφραση του στη ζύμη Pichia Pastoris, καθώς και ο βιοχημικός χαρακτηρισμός του παραγόμενου ενζύμου. Καθώς το γονίδιο που απομονώθηκε μέσω της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) από το γενωμικό DNA του μύκητα περιείχε ένα εσώνιο, ακολούθησε in vitro μάτισμα του με τη μέθοδο της Splicing by Overlapping Extension PCR, όπου πραγματοποιήθηκε ενίσχυση των δύο κωδικοποιουσών περιοχών το γονιδίου. Μέσω της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης επικάλυψης/επέκτασης πραγματοποιήθηκε παραγωγή τμημάτων DNA που προέρχονταν από τη συνένωση των δύο αυτών περιοχών. Έπειτα, η επιθυμητή αλληλουχία απομονώθηκε και εισήχθη στον πλασμιδιακό φορέα pPICZαΑ και μετά τη γραμμικοποίηση του, ακολούθησε μετασχηματισμός κυττάρων του ζυμομύκητα P. pastoris με ηλεκτροδιάτρηση. Η έκφραση της ανασυνδυασμένης πρωτεϊνης από τα μετασχηματισμένα στελέχη μελετήθηκε στον εξωκυτταρικό χώρο, παρουσιάζοντας τη μέγιστη ενεργότητα την 4η μέρα καλλιέργειας σε υπόστρωμα κατεχίνης. Επιπλέον, πραγματοποιήθηκε μελέτη για τη βελτιστοποίηση των καλλιεργειών ως προς τη συγκέντρωση χαλκού, με μέγιστη ενεργότητα να παρουσιάζεται για συγκέντρωση χαλκού 25 μM. Μετά τον καθαρισμό του ενζύμου, πραγματοποιήθηκε ηλεκτροφόρηση σε πήκτη πολυακρυλαμιδίου, όπου εμφανίστηκαν παραπάνω από μία ζώνες. Η ζώνη που εμφανίστηκε στα 47 kDa ανήκει στην MtOx60685, ενώ οι παραπάνω ζώνες θεωρείται ότι αντιστοιχούν σε διαφορετικές γλυκοζυλιώσεις της πρωτεϊνης. Με σκοπό την εύρεση της δράσης του ενζύμου πραγματοποιήθηκαν δοκιμές σε διάφορα υποστρώματα. Από τα υποστρώματα αυτά, μέγιστη ενεργότητα παρατηρήθηκε ποιοτικά στο υπόστρωμα 4-χλωροκατεχόλη, ενώ παρατηρήθηκε δράση σε ένα μεγάλο εύρος υποστρωμάτων, όπως στην κατεχίνη, στην επικατεχίνη, στη γουαιακόλη και στη L- τυροσίνη μετά από προσθήκη L- ντοπαμίνης. Εφόσον η ενεργότητα του ενζύμου σε μονοφαινολικά υποστρώματα ήταν μηδαμινή, το ανασυνδυασμένο ένζυμο χαρακτηρίστηκε ως κατεχολοξειδάση. Όσον αφορά τον χαρακτηρισμό του ανασυνδυασμένου ενζύμου, η βέλτιστη θερμοκρασία υπόλογίστηκε στους 65 οC και βέλτιστο pH δράσης το 7.5 σε υπόστρωμα 4- χλωροκατεχόλη. Αναφορικά με τη θερμική σταθερότητα του ενζύμου, παρατηρήθηκε ότι η πρωτεϊνη είναι αρκετά θερμοσταθερή στους 40 οC (πάνω από 90% μετά από 24 h) ενώ ύστερα από επώαση στους 50 οC για μία ημέρα χάνει 60% της ενεργότητάς του. Μετά από επώαση στους 60 οC η πρωτεϊνη χάνει περίπου το 75% της ενεργότητας μετά το πέρας των 5 h, ενώ στους 70 οC από τη πρώτη μισή ωρά χάνεται το 90% της ενεργότητας.The purpose of the present diploma thesis is the isolation of a gene (MtOx60685) from the ascomycete Myceliophtora thermophila which encodes a catechol oxidase, the expression of this protein in the yeast Pichia Pastoris and the biochemical characterizatio n of the produced enzyme. As the gene was isolated using the polymerase chain reaction (PCR) from the genomic DNA of the fungus which contained an intron, the in vitro splicing with the method of Overlapping Extension PCR followed, during which the amplifi cation of the two coding regions in the gene was performed. The overlap / extension polymerase chain reaction method was used in the production of DNA fragments derived from the junction of these two regions. The desired sequence was isolated and inserted into the pPICZ α A vector and after linearization of the recombinant plasmid, the procedure of transformation of the cells of the yeast P. pastoris by electroporation took place. The expression of the recombinant protein from the transformed colonies was stu died in the extracellular space, showing the maximum activity of the culture on day 4, using catechin as substrate. Additionally, a study was also conducted in order to optimize the copper concentration of the cultures, where the maximum activity occurs on copper concentration of 25 μM. The result of the purification was evaluated using polyacrylamide gel electrophoresis revealing more than one bands. The band that appeared at 47 kDa belongs to MtOx60685, while the rest bands correspond to different glycosy lations of the protein. In order to determine the enzyme activity, assays were performed on various substrates. Out of these substrates, the maximum activity was observed qualitatively in 4 - chlorocatechol, while activity in general was observed over a wide range of substrates, such as catechin, epicatechin, guaiacol and L - tyrosine after adding L - dopamine. Since the activity in mono - phenolic substrates was minimal , the recombinant enzyme was characterized as catechol oxidase. The optimal temperature of act ion was calculated at 65 °C and the optimal pH of action 7.5 in 4 - chlorocatechol. With respect to the thermal stability of the enzyme it was 7 observed that the protein is sufficiently thermostable at 40 °C (more than 90% after 24 h) and after incubation at 50 °C for one day it loses 60% of its activity. After incubation at 60 ° C the protein loses about 75% of its activity in 5 h, while at 70 °C after the first half hour 90% of its activity is losthttp://dx.doi.org/10.26240/heal.ntua.12240http://dspace.lib.ntua.gr/xmlui/handle/123456789/42887greDefault LicenseΕτερόλη έκφρασηMyceliophthora thermophilaΧαρακτηρισμόςΒιοτεχνολογίαΚλωνοποίησηBiotechnologyCloningCharacterisationCatechol-oxidaseHeterologous expressionEτερόλογη έκφραση και χαρακτηρισμός μιας κατεχολ-οξειδασης από το θερμόφιλο μύκητα Myceliophthora thermophilabachelorThesis2016-02-22Βιομηχανική ΒιοτεχνολογίαIndustrial BiotechnologyFrascati 42Πτυχιακή εργασίαBachelor thesisΕθνικό Μετσόβιο ΠολυτεχνείοGreek Aggregator OpenArchives.gr | National Documentation Centre (EKT)other