ntuaΤόπακας, ΕυάγγελοςΚέκος, ΔημήτριοςΤσακανίκας, ΆγγελοςΖαχαροπούλου, ΜαρίαZacharopoulou, MariaΗ παρούσα διπλωματική εργασία εστιάζει στην παραγωγή βιοαιθανόλης από στέλεχος αραβοσίτου (corn stover) και στη βελτίωση των επιμέρους σταδίων της διεργασίας. Στο πρώτο μέρος της εργασίας μελετήθηκε η παραγωγή βιοαιθανόλης από στέλεχος αραβοσίτου με διαφορετικές προκατεργασίες και σε συνθήκες υψηλής συγκέντρωσης στερεών (high gravity). Εκπονήθηκαν πειράματα με τρία υλικά τα οποία είχαν προκατεργαστεί με τη μέθοδο έκρηξης ατμού- steam explosion (Δείγματα Α-Γ) και ένα υλικό που είχε προκατεργαστεί με τη μέθοδο organosolv (Δείγμα Δ). Τα δείγματα που είχαν υποστεί έκρηξη ατμού διέφεραν στις συνθήκες της προκατεργασίας και ειδικότερα στη συγκέντρωση προστιθέμενου H2SO4 (Δείγμα Α: 0% H2SO4, Δείγμα Β: 0.2% H2SO4, Δείγμα Γ: 1.0% H2SO4). Στόχος των πειραμάτων ήταν αφενός η επιλογή της βέλτιστης εκ των συνθηκών κατά την έκρηξη ατμού (Δείγματα Α-Γ) και, αφετέρου, η σύγκριση της αποτελεσματικότητας των δύο μεθόδων προκατεργασίας (Δείγματα Α-Γ και Δ). Ο κύριος άξονας της εργασίας περιλαμβάνει ανάλυση σύστασης, ανάλυση κρυσταλλικότητας, δοκιμαστική ενζυμική υδρόλυση σε μικρή κλίμακα και ζύμωση σε μικρή κλίμακα, ώστε να διαπιστωθούν οι βέλτιστες συνθήκες κάθε σταδίου της διεργασίας, αλλά και να επιλεγούν τα υλικά με την καλύτερη συμπεριφορά. Στη συνέχεια, για τα δείγματα που επιλέχθηκαν από τις σειρές πειραμάτων ακολούθησε υδρόλυση και ζύμωση σε υψηλές συγκεντρώσεις στερεών (high gravity), με στόχο την επίτευξη υψηλής συγκέντρωσης αιθανόλης στο μίγμα της ζύμωσης. Αρχικά, η ανάλυση σύστασης των υλικών (πρωτόκολλο NREL) υπέδειξε απομάκρυνση λιγνίνης στο Δείγμα Δ και απομάκρυνση ημικυτταρίνης στα δείγματα που κατεργάστηκαν με έκρηξη ατμού, με τη μεγαλύτερη απομάκρυνση να παρουσιάζεται στο Δείγμα Γ λόγω της υψηλής συγκέντρωσης προστιθέμενου οξέος. Παράλληλα, παρατηρήθηκε υποβάθμιση στο Δείγμα Γ πιθανότατα λόγω υδρόλυσης της κυτταρίνης κατά την προκατεργασία. Η ανάλυση κρυσταλλικότητας των υλικών πραγματοποιήθηκε με περίθλαση ακτίνων X και υπέδειξε αύξηση κρυσταλλικότητας των προκατεργασμένων υλικών σε σχέση με την πρώτη ύλη (CrIπρώτης ύλης= 55.5, CrIΑ= 59.8, CrIΒ= 57.7, CrIΓ= 64.8, CrIΔ= 62.1), με τη μεγαλύτερη αύξηση να εμφανίζεται στα υλικά από όπου απομακρύνθηκε μεγαλύτερο ποσοστό ημικυτταρίνης ή/και λιγνίνης. Ακολούθησε ενζυμική υδρόλυση μικρής κλίμακας σε συμβατικό σύστημα ανάδευσης (κωνικές φιάλες) με χαμηλή συγκέντρωση στερεών (10% w/v), όπου ελέγχθηκε η επίδραση της διαφορετικής συγκέντρωσης ενζύμου στην υδρόλυση της βιομάζας συναρτήσει του χρόνου (enzyme loading) για όλα τα υλικά. Παρατηρήθηκε υψηλότερη απελευθέρωση γλυκόζης στα Δείγματα Β και Δ, με τις μέγιστες συγκεντρώσεις γλυκόζης στο πέρας της υδρόλυσης (72h) να διαμορφώνονται ως εξής: Α (49.1 ± 0.99 g/L), Β (53.2 ± 1.23 g/L), Γ (41.7 ± 0.62 g/L), Δ (59.4 ± 0.45 g/L). Οι μέγιστες αποδόσεις υδρόλυσης βάσει της θεωρητικής απελευθερούμενης ποσότητας γλυκόζης κυμαίνονταν στο διάστημα 74%90%, μέσα στα πλαίσια των τιμών που αναφέρονται στη βιβλιογραφία. Επιλέχθηκε, τέλος, η συγκέντρωση 12 mg/g DM ως βέλτιστο ενζυμικό φορτίο, η οποία συμβιβάζει την αποτελεσματικότητα της υδρόλυσης και το κόστος του προστιθέμενου ενζύμου. Στη συνέχεια, έλαβε χώρα ζύμωση μικρής κλίμακας με τον μικροοργανισμό Saccharomyces cerevisiae σε κωνικές φιάλες και συγκέντρωση στερεών 10%w/v για τα Δείγματα Α-Δ. Τα υλικά ζυμώθηκαν στις βέλτιστες συνθήκες ενζυμικού φορτίου και χρόνου προϋδρόλυσης που είχαν διαπιστωθεί από τις προηγούμενες σειρές πειραμάτων. Οι μέγιστες συγκεντρώσεις αιθανόλης που επιτεύχθηκαν για τα δείγματα Α-Δ είναι: Α (21.2 g/L), Β (22.7 g/L), Γ (18.4 g/L) και Δ (15.4 g/L). Η χαμηλή συγκέντρωση παραγόμενης αιθανόλης στο Δείγμα Δ, παρά την καλή συμπεριφορά του κατά την υδρόλυση, αποδόθηκε στην πιθανή παρουσία κάποιου παρεμποδιστή της ζύμωσης στο υδρόλυμα. Από τα προηγούμενα πειράματα μικρής κλίμακας, επιλέχθηκε να μελετηθούν τα Δείγματα Β και Δ σε συνθήκες high gravity (24% w/w), σε μη συμβατικό σύστημα ανάδευσης (αναδευτήρας ελεύθερης πτώσης/ free fall mixer). Διερευνήθηκε αρχικά η απελευθέρωση γλυκόζης κατά την προϋδρόλυση, με τις τιμές συγκέντρωσης για τις 12h και τις 24h να είναι: Β (12h: 130.5 g/L, 24h: 148.3 g/L), Δ (12h: 118.6 g/L, 24h: 141.1 g/L). Κατά τη ζύμωση των υδρολυμάτων, μελετήθηκε η επίδραση της προσθήκης επιπλέον ποσότητας κυτταρινολυτικού ενζύμου για το Δείγμα Β (-/+). Οι μέγιστες συγκεντρώσεις αιθανόλης για το Δείγμα Β ήταν: 12h(-): 64.9 ± 2.96 g/L, 12h(+): 66.5 ± 1.06 g/L, 24h(-): 75.5 ± 4.93 g/L, 24(+): 71.5 ± 1.63 g/L. Το Δείγμα Δ στο ενζυμικό φορτίο 9 mg/g DM παρουσίασε μικρότερη συγκέντρωση αιθανόλης, 64.5 ± 1.28 g/L. Οι συγκεντρώσεις αιθανόλης που επιτεύχθηκαν και στα δύο υλικά είναι από τις υψηλότερες που εμφανίζονται στη βιβλιογραφία για λιγνινοκυτταρινούχα βιομάζα. Τέλος, πραγματοποιήθηκε υδρόλυση σε διαφορετικές συγκεντρώσεις αρχικών στερεών (6% w/v, 8% w/v, 10% w/v, 12% w/v) ώστε να διαπιστωθεί η επίδραση στην ενζυμική υδρόλυση. H απόδοση της υδρόλυσης στα συμβατικά συστήματα μειώθηκε σχεδόν γραμμικά με την αύξηση της συγκέντρωσης στερεών, ενώ αυξήθηκε ραγδαία στις υψηλές συγκεντρώσεις στερεών του συστήματος αναδευτήρα ελεύθερης πτώσης. Αποδείχθηκε έτσι η σημασία του συστήματος ανάδευσης για την επιτυχία της διεργασίας. Στο δεύτερο μέρος της εργασίας, πολλαπλασιάστηκε και εκφράστηκε γονίδιο GH30 με πιθανή ξυλανολυτική δράση (putative xylanase). Στόχος της παραγωγής του καινοτόμου γονιδίου ήταν η διερεύνηση της συνεργιτικής δράσης που πιθανώς να έχει στην υδρόλυση της βιομάζας, ώστε να αυξηθεί ακόμα περισσότερο η απόδοση της συνολικής διεργασίας. Η έκφραση πραγματοποιήθηκε με συνθετικό, codon-optimized, γονίδιο του μικροοργανισμού Myceliophthora thermophila. Το γονίδιο πολλαπλασιάστηκε και υπέστη επεξεργασία με τεχνικές ανασυνδυασμένου DNA σε ξενιστή Escherichia coli TOP10. Στη συνέχεια, προσαρτήθηκε σε πλασμίδιο pPICZαC, αυξήθηκε και εκφράστηκε σε ζύμη Pichia pastoris (στέλεχος Χ33). Η ενεργότητα του ενζύμου μελετήθηκε με τρυβλίο ελέγχου (Plate Assay) που περιείχε πιθανά υποστρώματα του.The present diploma thesis focuses on the production of bioethanol from corn stover and the improvement of the various stages of the production process. In the first part of the thesis the production of bioethanol from corn stover was studied, pertaining to different pretreatment methods and in high gravity co nditions. Three steam -exploded samples (A-C) and an organosolv-pretreated sample were tested. Samples A to C differed in the conditions of pretreatment, regarding the added concentration of H2SO4 (Sample A: 0% H2SO4, Sample B: 0.2% H2SO4, Sample C: 1.0% H2SO4). It was, firstly, intended to choose the best steam explosion conditions for Samples A- C and, secondly, to compare the efficacy of both pretreatment methods (Samples A -C and D).The main experimental focus of this work includes biomass composition analysis, crystallinity analysis, enzymatic hydrolysis on a small scale, and fermentation on a small scale, in order to establish the optimal conditions of each process stage, and to select the samples with the best behavior. Afterwards, the samples that were selected from the above series of experiments were hydrolyzed and fermented at high solids concentrations (high gravity), in order to achieve a high concentration of ethanol in the fermentation broth. To begin with, biomass composition analysis (NREL) indicated removal of lignin in Sample D and removal of hemicellulose in the samples treated by steam explosion.The greatest removal occurred in Sample C because of its high concentration of added acid. Furthermore, deterioration in the Sample C was observed probably due to hydrolysis of cellulose during the retreatment. Crystallinity analysis of materials was performed by X -ray diffraction and showed increased crystallinity of the samples comparing to the raw material (CrIraw= 55.5, CrIA = 59.8, CrIB= 57.7, CrIc= 64.8, CrID= 62.1). The largest increase appeared in the materials where a greater percentage of hemicellulose and/or lignin was removed. Furthermore, enzymatic hydrolysis on a small scale in a conventional stirring system (flasks) with a low solids concentration (10% w/v) was performed. The experiment tested the effect of different enzyme concentrations in the hydrolysis of the biomass as a function of time (enzyme loading). There was a higher release of glucose in samples B and D, the maximum glucose oncentrations (at 72h) being as follows: A (49.1 ± 0.99 g/L), B (53.2 ± 1.23 g/L), C (41.7 ± 0.62 g/L), D (59.4 ± 0.45 g/L). The maximum hydrolysis yields -based on the theoretical amount of glucose released- ranged in the interval 74%-90% (within the values reported in the literature). Finally, the concentration of 12 mg/g DM was chosen as the optimal enzyme load, which compromises the efficiency of hydrolysis and the cost of the added enzyme. Moreover, fermentation was held on a small scale in flasks using the microorganism Saccharomyces cerevisiae and in 10% w/v solids concentration. The materials were treated in the optimal enzyme load that had been established by the previous series of experiments. The maximum ethanol concentrations obtained for samples A-D were: A (21.2 g/L), B (22.7 g/L), C (18.4 g/L) and D (15.4 g/L). The low concentration of ethanol produced in Sample D, despite its good behavior upon hydrolysis, was attributed to the possible presence of a fermentation inhibitor in the hydrolysate. From the above small-scale experiments, samples B and D were selected to be studied in high gravity conditions (24% w/w), in a non-conventional stirring system (free fall mixer). The glucose concentration values for 12h and 24h pre-hydrolysis we re: B (12h: 130.5 g/L, 24h: 148.3 g/L), D (12h: 118.6 g/L, 24h: 141.1 g/L). During the fermentation of the hydrolyzate, the effect of adding an additional quantity of cellulolytic enzyme was studied for Sample B (-/+). The maximum concentrations of ethanol for Sample B were: 12h (-): 64.9 ± 2.96 g/L, 12h (+): 66.5 ± 1.06 g/L, 24h (-): 75.5 ± 4.93 g/L, 24 (+): 71.5 ± 1.63 g/L. Sample D showed a lower concentration of ethanol: 64.5 ± 1.28 g/L. The ethanol concentrations achieved in both materials are among the highest displayed in literature of lignocellulosic biomass. Finally, hydrolysis at different solids concentrations (6% w/v, 8% w/v , 10% w/v, 12% w/v) was tested to determine the effect on enzyme hydrolysis. The hydrolysis yield decreased almost linearly with the increasing concentration of solids in conventional systems, but grew rapidly at high solids concentrations of the free fall mixer system. Thus the importance of the stirring system on the efficacy of the process was demonstrated. In the second part of the present thesis, a GH30(CAZy) gene with a putative xylanolytic action was multiplied and expressed. The aim of the novel enzyme production was to investigate the synergistic effect that it may have on the hydrolysis of biomass, to increase further the efficiency of the overall process. The expression was carried out with a synthetic, codon-optimized gene of the microorganism Myceliophthora thermophila. The gene was amplified and treated with DNA techniques, and was inserted in the host microorganis m Escherichia coli (strain TOP10. It was then attached to the plasmid pPICZaC and expressed in Pichia pastoris cells (strain X33). The activity of the enzyme was studied by Plate Assay, with a plate containing its potential substrates.http://dx.doi.org/10.26240/heal.ntua.13271http://dspace.lib.ntua.gr/xmlui/handle/123456789/43343greDefault LicenseΈκρηξη ατμούΒιοαιθανόληΣτέλεχος αραβοσίτουCorn stoverSteam explosion pretreatmentFree fall mixerGlucosyl-hydrolase GH30 (CAZy)BioethanolHigh gravity enzymatic hydrolysisOrganosolv pretreatmentΠαραγωγή βιοαιθανόλης από προκατεργασμένα με έκρηξη ατμού στελέχη αραβοσίτου και βελτίωση της διεργασίας με τη χρήση καινοτόμων βιοκαταλυτώνbachelorThesis2016-07-04Βιομηχανική ΒιοτεχνολογίαIndustrial BiotechnologyFrascati 42Πτυχιακή εργασίαBachelor thesisΕθνικό Μετσόβιο ΠολυτεχνείοGreek Aggregator OpenArchives.gr | National Documentation Centre (EKT)other