ntuaΤόπακας, ΕυάγγελοςΧαραλάμπους, ΑικατερίνηΚέκος, ΔημήτριοςΧαλιμά, Αγγελική- ΕλένηChalima, Angeliki- EleniΣκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η ενίσχυση της δράσης μονοφαινολάσης μίας πολυφαινολοξειδάσης του θερμόφιλου μύκητα Myceliophthora thermophila με μεθόδους πρωτεϊνικής μηχανικής. Για τις ανάγκες της πειραματικής διαδικασίας χρησιμοποιήθηκε ο ανασυνδυασμένος πλασμιδιακός φορέας pPICZαA που περιείχε την κωδικοποιούσα περιοχή του γονίδιου έκφρασης της πολυφαινολοξειδάσης MtOx60685. To πλασμιδιακό DNA υπέστη ξεχωριστά τις σημειακές μεταλλάξεις G292N (MutOx1), L306A (MutOx2) και Y296V (MutOx3) με την τεχνική της PCR, μέσω κατευθυνόμενης μεταλλαξιγένεσης. Ακολούθησε μετασχηματισμός του στελέχους Χ-33 της ζύμης Pichia pastoris με τις προκύπτουσες μεταλλαγμένες αλληλουχίες και η ετερόλογη έκφραση της πρωτεΐνης που αυτές κωδικοποιούν. Το ένζυμο MtOx, καθώς και οι μεταλλαγμένες πρωτεΐνες, μετά την παραλαβή και τον καθαρισμό τους, εξετάστηκαν ως προς την εξειδικευμένη καταλυτική τους δράση σε ένα πλήθος φαινολικών υποστρωμάτων. Οι ενεργότητες των εξεταζόμενων ενζύμων σε κάθε υπόστρωμα, προσδιορίστηκαν φασματομετρικά και διέφεραν μεταξύ τους, χωρίς να παρατηρείται κάποιο συγκεκριμένο μοτίβο. Το ένζυμο που έφερε τη μετάλλαξη G292N παρουσίασε τη μεγαλύτερη αύξηση του λόγου δράσης μονοφαινολάσης/διφαινολάσης σε 1,89, τη στιγμή που το αρχικό μη μεταλλαγμένο ένζυμο εξέφρασε μηδενική καταλυτική δράση στο υπόστρωμα L-τυροσίνη. Τα ένζυμα που έφεραν τις μεταλλάξεις L306A και Y296V αντίστοιχα φανέρωσαν βελτιωμένη ενεργότητα στα πολυφαινολικά υποστρώματα. Στα πλαίσια του περαιτέρω χαρακτηρισμού των μεταλλαγμένων ενζύμων προσδιορίστηκαν οι τιμές pH και θερμοκρασίας που εξασφαλίζουν τη μέγιστη ενεργότητα αυτών, καθώς και η θερμοσταθερότητά τους. Πιο θερμοσταθερό αποδείχθηκε το ένζυμο που φέρει τη μετάλλαξη G292N. Όλα τα μεταλλαγμένα ένζυμα παρουσίασαν τη μέγιστη ενεργότητα σε θερμοκρασία T=60oC και βέλτιστο pH δράσης μεταξύ των τιμών 6-8. Ακολούθησαν κινητικές μελέτες για τον προσδιορισμό των κινητικών σταθερών Michaelis-Menten των εξεταζόμενων ενζύμων στα υποστρώματα 4-χλωροκατεχόλη και κατεχόλη. Τη μεγαλύτερη καταλυτική απόδοση στο υπόστρωμα της χλωροκατεχόλης εμφάνισε το MtOx (kcat/Km=3006,2±197,7 mM-1s-1), ενώ στην κατεχόλη το μεταλλαγμένο ένζυμο MtOx2 (kcat /Km=61,7±9,3mM-1s-1). Παράλληλα, στα πλαίσια ενίσχυσης της δράσης μονοφαινολάσης, πραγματοποιήθηκε μία επιπλέον μετάλλαξη του αρχικού γονιδίου με σκοπό την αποκοπή της πεπτιδικής αλληλουχίας που παρεμβάλλεται μεταξύ των αμινοξέων Ι187 και S199. Τα δύο νουκλεοτιδικά τμήματα εκατέρωθεν της αλληλουχίας προς αποκοπή πολλαπλασιάστηκαν και απομονώθηκαν με PCR και ακολούθησε συνένωση αυτών. Το τεμαχισμένο μεταλλαγμένο γονίδιο χρησιμοποιήθηκε για τον ανασυνδυασμό του πλασμιδιακού φορέα pCR® Blunt. Αναμένεται ο μετασχηματισμός της ζύμης P. pastoris, η ετερόλογη έκφραση της μεταλλαγμένης πρωτεΐνης και ο χαρακτηρισμός της.The purpose of this specific diploma thesis was the protein engineering of a polyphenol oxidase from the thermophilic fungus Myceliophthora thermophila towards enhancement of its monophenolase activity. The recombined plasmid pPICZαA which included the coding sequence of polyphenol oxidase gene MtOx6068 was used as a template. The different mutations G292N (MutOx1), L306A (MutOx2) and Y296V (MutOx3) were introduced into the plasmid DNA through site-directed mutagenesis, using PCR. The mutated genes were inserted in the methylotrophic yeast Pichia pastoris through transformation and accordingly, the mutated proteins where heterologously expressed. The substrate specificity of the enzyme MtOx, as well as that of the mutated proteins, was examined on a wide range of phenolic substrates. The activities of the examined enzymes in each substrate were determined spectroscopically and found to differ between them, without presenting any special pattern. The ratio of monophenolase/diphenolase activity of enzyme MutOx1 was substantially increased to the value of 1,89, whereas the wild type showed no tyrosinase activity on L-tyrosine. The enzymes which carried the mutations L306A and Y296V respectively presented an enhanced activity towards polyphenolic substrates. The mutated enzymes were also characterized in terms of pH- and T- optimum, as well as in terms of thermostability. The enzyme MutOx1 proved to be the most thermostable between the four examined proteins. The T-optimum of all the mutated enzymes was 60oC and the pH-optimum was between the values 6-8. Furthermore the Michaelis-Menten constants of the oxidation of 4-chlorocathechol and catechol catalyzed by the four enzymes were calculated. The highest catalytic efficiency in the substrate 4-chlorocatechol was exhibited by MtOx (kcat/Km=3006,2±197,7 mM-1s-1), whereas in catechol by MutOx2 (kcat /Km=61,7±9,3mM-1s-1). Following the purpose of enhancing the monophenolase activity of the enzyme MtOx, one more mutation was introduced in the wild type gene, in order to cut out a sequence of 11 amino acids between Ι187 and S199. The rest gene sequences located on the right and left side of the corresponding 33 nucleotide- part were amplified and isolated with PCR. They were afterwards combined in one final mutated gene which was used for the recombination of the plasmid pCR® Blunt. The transformation of the yeast P. pastoris, the heterologous expression of the mutated protein (MutOx4) and its characterization are yet to be carried out.http://dx.doi.org/10.26240/heal.ntua.13661http://dspace.lib.ntua.gr/xmlui/handle/123456789/44049greDefault LicenseΤυροσινάσηΠρωτεϊνική μηχανικήΚατευθυνόμενη μεταλλαξιγένεσηΠολυφαινολοξειδάσηΔράση μονοφαινολάσηςPolyphenoloxidaseProtein engineeringMonophenolase activitySite-directed mutagenesisTyrosinaseΕνίσχυση της δράσης μονοφαινολάσης μιας πολυφαινολοξειδάσης του μύκητα Myceliophthora thermophila με μεθόδους πρωτεϊνικής μηχανικήςbachelorThesis2016-11-30T10:45:25ZΒιομηχανική ΒιοτεχνολογίαIndustrial BiotechnologyFrascati 42Πτυχιακή εργασίαBachelor thesisΕθνικό Μετσόβιο ΠολυτεχνείοGreek Aggregator OpenArchives.gr | National Documentation Centre (EKT)other