Viruses are the major cause of pediatric respiratory tract infection causing significant morbidity and mortality. This study aimed to determine the distribution of human rhinovirus (hRV), human metapneumovirus (hMPV), human bocavirus (hBoV) and human coronavirus (hCoV) type 229E and OC43 in children diagnosed as having a respiratory tract infection, over the winter period of the years 2005 to 2008. We also focus on the evaluation of the genetic diversity of the newly recognized and poorly studied, within the Greek population, hMPV and hBoV positive strains, classifying them into the main, already characterized, genetic lineages for each virus and compare them with other European strains. Molecular assays used in this study included molecular methods specific for conserved regions between the different circulating strains which included a reverse - transcription PCR for the F gene of hMPV, a nested reverse - transcription PCR for the 5’-UTR of hRV, a real - time PCR for the NP-1 gene of hBoV and a reverse - transcription multiplex real - time PCR for the N gene of hCoV. These assays were employed to screen respiratory specimens, collected by clinicians of the Influenza sentinel system and of outpatient pediatric clinics, for identification of the above mentioned respiratory viruses. In total, clinical specimens from 3307 pediatric patients including males (n=1856, 56.1%) and females (n= 1451, 43.9%), aged from 0 - ≤18 yo, were enrolled in the study. In addition, nucleotide sequences were determined for representative strains of hMPV and hBoV using non-conserved regions of their viral genome.Of 3307 specimens tested, 905 (27.4%) were positive for at least one virus and included 537 rhinoviruses, 193 bocaviruses, 188 metapneumoviruses and 73 coronaviruses. Simultaneous presence of two or three viruses was observed in 86 of the above positive cases. The majority of positive cases occurred during the beginning and the end of every winter season while preschool children seemed to be infected more frequently than the older ones. Clinical symptoms more frequently associated with respiratory infection from the above mentioned viruses included cough (93%), coryza (85.6%) and fever (85%). Lower respiratory infection was observed in 31.7% of positive patients. Viral strains selected throughout the study period where further characterized at the molecular level and phylogenetic trees of the G-gene and of the VP1/VP2 gene were generated for hMPV and hBoV, respectively. Phylogenetic analysis of a total of 50 viral strains for the two viruses revealed the circulation of hMPV genetic subtype B2, presenting with a nucleotide identity of 92-100% with each other, while hBoV isolates clustered within species 1 with the majority of them (84.6%) belonging to genotype ST2. The fields of medical research and diagnosis have grown tremendously with the advent of novel molecular techniques, allowing the detection of several respiratory viruses which contributed to a high proportion of up to 27.4% to respiratory tract infections. While in Greece epidemiological study is limited to influenza virus, this kind of studies could facilitate the understanding of viral biology and pathogenesis thus contributing to an effective restriction of their transmission. The study of developmental evolution through phylogenetic analysis and genotyping characterization could further contribute to a rapid and effective response to new species that can lead to an epidemic or even pandemic with enormous socio-economic impacts.
Οι λοιμώξεις του αναπνευστικού συστήματος είναι από τις πιο συνηθισμένες ασθένειες παγκοσμίως, προκαλώντας σημαντικό ποσοστό νοσηρότητας και θνησι-μότητας στους ανθρώπους. Η παρούσα διδακτορική διατριβή είχε ως σκοπό την ανάπτυξη και βελτιστοποίηση μοριακών μεθόδων για τη διερεύνηση της συμμετοχής τεσσάρων αναπνευστικών ιών, του ανθρώπινου ρινοϊού (hRV), του ανθρώπινου μεταπνευμονοϊού (hMPV), του ανθρώπινου μπόκα ιού (hBoV) και του ανθρώπινου κορόνα ιού (hCoV), τύπων 229Ε και OC43, σε λοιμώξεις του ανώτερου και κατώτε-ρου αναπνευστικού συστήματος. Ακολούθησε η μελέτη της επιδημιολογίας και η συλλογή κλινικών δεδομένων με σκοπό την πιθανή συσχέτισή τους με την εμφάνιση του κάθε ιού, καθώς και η ανάλυση της αλληλουχίας αντιπροσωπευτικών στελεχών του hMPV και του hBoV που κυκλοφορούσαν στη νότια Ελλάδα κατά τη διάρκεια της υπο-εξέτασης περιόδου.Το υλικό που χρησιμοποιήθηκε, συλλέχθηκε κατά τη χειμερινή περίοδο τριών συνεχόμενων ετών, 2005-06, 2006-07 και 2007-08, και περιελάμβανε ρινικά ή φαρυγγικά επιχρίσματα και εκπλύματα από ασθενείς ηλικίας 0-18 ετών που εμφάνιζαν συμπτώματα λοίμωξης του αναπνευστικού συστήματος. Για την ανίχνευση των παραπάνω ιών χρησιμοποιήθηκαν μοριακές μέθοδοι, με τη χρήση εκκινητών που ήταν ειδικοί για συντηρημένες περιοχές του γονιδιώματός τους, οι οποίες περιελάμβαναν μία απλή ανάστροφής μεταγραφής PCR για το γονίδιο της πρωτεΐνης σύντηξης του hMPV, μία διπλή ανάστροφής μεταγραφής PCR για την 5’ αμετάφραστη περιοχή του γονιδιώματος του hRV, μία PCR πραγματικού χρόνου για το γονίδιο της γλυκοπ-ρωτεΐνης του hBoV και μία ανάστροφής μεταγραφής πολλαπλή PCR πραγματικού χρόνου για το γονίδιο της νουκλεοκαψιδικής πρωτεΐνης του hCoV. Για την ανάλυση της αλληλουχίας των hMPV και hBoV χρησιμοποιήθηκαν μη-συντηρημένες περιοχές και η συσχέτισή τους έγινε μέσω απεικόνισης σε φυλογενετικά δέντρα.Συνολικά, 3307 δείγματα συμπεριλήφθηκαν στη μελέτη, από τα οποία 905 (27.4%) βρέθηκαν θετικά για κάποιον από τους υπό μελέτη αναπνευστικούς ιούς. Συγκεκριμένα, 537 ασθενείς βρέθηκαν θετικοί σε hRV, 193 σε hBoV, 188 σε hMPV και 73 σε hCoV. Σε 86 από τις παραπάνω περιπτώσεις παρατηρήθηκε ταυτόχρονη ανίχνευση δύο ή και τριών ιών. Το μεγαλύτερο ποσοστό ανίχνευσης παρατηρήθηκε κατά τους πρώτους και τελευταίους μήνες της υπό μελέτης περιόδου ενώ οι ασθενείς προσχολικής ηλικίας φάνηκε να είναι πιο επιρρεπείς στη λοίμωξη από τους συγκεκ-ριμένους αναπνευστικούς ιούς. Τα κλινικά συμπτώματα που εμφάνιζε η πλειοψηφία των θετικών ασθενών ήταν βήχας (93%), καταρροή (85.6%) και πυρετός (85%) ενώ υψηλά ήταν και τα ποσοστά λοίμωξης του κατώτερου αναπνευστικού συστήματος που περιελάμβανε πνευμονία και βρογχιολίτιδα. Αντιπροσωπευτικά δείγματα που βρέθηκαν θετικά για τους ιούς hMPV και hBoV κατά τις τρεις χειμερινές περιόδους επιλέχθηκαν για να μελετηθούν φυλογενετικά. Συγκεκριμένα, η σύγκριση της αλληλουχίας 24 στελεχών για τον hMPV έδειξε ότι όλα ανήκαν στη γενετική ομάδα Β2 και παρουσίαζαν μεταξύ τους νουκλεοτιδική ομολογία 91.9-100% και αμινοξική ομολογία 84.7-100%. Αντίστοιχα, η σύγκριση της αλληλου-χίας 26 στελεχών για τον hBoV έδειξε ότι η πλειοψηφία (84.6%) ανήκε στο γονότυπο St2, 2 από τα ελληνικά στελέχη ανήκαν στον γονότυπο St1, ενώ τα υπόλοιπα 2 σχημάτιζαν έναν τρίτο κλάδο που διέφερε εξίσου από τους δύο προηγούμενους γονοτύπους. Μεταξύ τους τα ελληνικά hBoV στελέχη παρουσίαζαν νουκλεοτιδική και αμινοξική ομολογία 98.2-100% και 95.6-100%, αντίστοιχα.Για την πραγματοποίηση της παρούσας διδακτορικής διατριβής καθοριστική ήταν η συμβολή των μοριακών τεχνικών καθώς η χρήση τους έχει αλλάξει ριζικά τη μελέτη του γενετικού υλικού και έχει συμβάλει σημαντικά στην ευρεία εφαρμογή της μοριακής βιολογίας στην ιατρική έρευνα και διάγνωση. Η μελέτη της επιδημιολογίας των αναπνευστικών ιών, που στην Ελλάδα περιορίζεται κυρίως στον ιό της γρίπης, μπορεί να βοηθήσει στην περαιτέρω κατανόηση της βιολογίας τους και του τρόπου παθογένειας και μετάδοσής τους ενώ η μελέτη της αναπτυξιακής εξέλιξης του γονιδιώματός τους μπορεί να συμβάλει στη γρήγορη και αποτελεσματική αντιμετώ-πιση νέων ειδών που μπορεί να οδηγήσουν σε επιδημία ή ακόμα και πανδημία με τεράστιες κοινωνικο-οικονομικές επιπτώσεις.
