Βιβλιογραφία : σ. 54-56
Η πρωτεΐνη HURP χαρακτηρίστηκε για πρώτη φορά στο ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC) και είναι στενά συνδεδεμένη με τον καρκίνο του μαστού. Πρόκειται για μία MAP πρωτεΐνη και αποτελεί μέρος ενός καλά χαρακτηρισμένου Ran- GTP συμπλόκου. Η HURP φέρει σήμα πυρηνικού εντοπισμού (NLS) στο αμινοτελικό της άκρο και αποτελεί στόχο της ιμπορτίνης- β, η οποία την μεταφέρει στον πυρήνα και απελευθερώνεται από την δράση της Ran- GTP. Η HURP έχει την ικανότητα να προσδένεται στους μικροσωληνίσκους και να επάγει τον πολυμερισμό τους, σταθεροποιώντας τους. Η έκφραση της πρωτεΐνης αυτής διαφέρει κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου και είναι ιστοειδική. Από πειράματα που πραγματοποιήθηκαν στον X. laevis έχει αποδειχτεί ότι η HURP στρατολογείται σε ένα σύμπλοκο που αποτελείται από τις XMAP215, TPX2, την κινάση Aurora A και την κινεσίνη Eg5. Το σύμπλοκο αυτό διευθετεί τους μικροσωληνίσκους από τη δομή αστέρα στη δομή ατράκτου. Ωστόσο, παρόμοιο σύμπλοκο δεν έχει χαρακτηριστεί στα θηλαστικά. Στόχος της παρούσας διπλωματικής εργασίας είναι η μελέτη των διαφορετικών επιπέδων έκφρασης και εντοπισμού της πρωτεΐνης HURP σε κυτταρικές σειρές οι οποίες αντιπροσωπεύουν διαφορετικά στάδια εξέλιξης ανθρωπίνου καρκίνου του μαστού και τελικά τη συσχέτιση των βασικών επιπέδων έκφρασης με την ανθεκτικότητα που αυτές παρουσιάζουν στο αντικαρκινικό φάρμακο ταξόλη. Οι κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιήθηκαν είναι οι MDA MB 435S, MDA MB 231, MDA MB 436, MCF7 και T47D. Για τον ημιποσοτικό προσδιορισμό των επιπέδων έκφρασης της HURP πραγματοποιήσαμε μια σειρά πειραμάτων με ανάλυση κατά Western blot ενώ με ανοσοφθορισμό ποσοτικοποιήθηκε η έκφραση της πρωτεΐνης και εντοπίστηκε η θέση της πάνω στη μιτωτική άτρακτο σε κάθε κυτταρική σειρά. Ακολούθως συγκρίναμε τα αποτελέσματα αυτά με την ανθεκτικότητα που παρουσιάζουν οι συγκεκριμένες κυτταρικές σειρές στην ταξόλη, βάσει της χρωματομετρικής μεθόδου του τετραζολικού άλατος WST-1.
Τα αποτελέσματα που λάβαμε από το western blot και τον ανοσοφθορισμό δείχνουν πως οι μεταστατικές κυτταρικές σειρές MDA MB 231 και MDA MB 435S παρουσιάζουν τα μεγαλύτερα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης, ακολουθούμενες από τις MCF7 και MDA MB 436, ενώ η κυτταρική σειρά T47D, παρουσιάζει την μικρότερη έκφραση σε σχέση με τις υπόλοιπες κυτταρικές σειρές που μελετήθηκαν, συμπεραίνοντας πως όσο αυξάνεται η έκφραση της πρωτεΐνης HURP τόσο πιο επιθετικές χαρακτηρίζονται οι κυτταρικές σειρές. Συγκρίνοντας τα παραπάνω επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης με τις IC50 τιμές που παρουσιάζουν στην ταξόλη, καταλήγουμε σε ένα γενικό μοντέλο, ότι οι κυτταρικές σειρές που εκφράζουν υψηλά επίπεδα HURP, παρουσιάζουν υψηλή ανθεκτικότητα στο αντικαρκινικό φάρμακο. Η κυτταρική σειρά MDA MB 231 που εκφράζει στα υψηλότερα επίπεδα την πρωτεΐνη, είναι εξαιρετικά ανθεκτική στην δράση της ταξόλης. Ωστόσο, η εξαίρεση στον παραπάνω κανόνα είναι η κυτταρική σειρά MDA MB 435S η οποία ενώ εκφράζει τη πρωτεΐνη σε πολύ υψηλά επίπεδα, ταυτόχρονα παρουσιάζει υψηλότερη ευαισθησία στη ταξόλη. Από τα παραπάνω αποτελέσματα προκύπτει ο καθοριστικής σημασίας ρόλος που έχει η πρωτεΐνη HURP στον καρκίνο του μαστού. Για αυτόν τον λόγο χρήζουν περαιτέρω πειράματα για την καλύτερη κατανόηση του μηχανισμού δράσης της πρωτεΐνης και του ρόλου που κατέχει στην εξέλιξη του καρκίνου του μαστού με απώτερο σκοπό τη χρήση της πρωτεΐνης ως προγνωστικό δείκτη και ως πιθανό στόχο αποτελεσματικότερης θεραπείας της ασθένειας.
HURP (Hepatoma Up Regulated Protein) is a mitotic spindle protein, associated with breast cancer and was firstly characterized in Hepatocellular Carcinoma. HURP is a microtubule associated protein (MAP) and is a part of a Ran- GTP associated complex. HURP has a nuclear localization signal (NLS), and importin- β, transports it into the nucleus. HURP is able to bind, bundle and stabilize microtubules. HURP’s expression is time and tissue specific and is regulated by Aurora A, a Ser/Thr kinase. In metaphase is localized on the kinetochore microtubules, with higher concentration in the vicinity of the chromosomes. Moreover, HURP is part of a chromatin-dependent pathway, responsible for the assembly of the mitotic spindle and it is found in X. laevis extracts as a component of a complex containing Aurora A, TPX2, XMAP15 and Eg5, which has the capacity to transform aster-like structures to spindle-like microtubules. The purpose of this thesis is to examine the expression and localization of HURP on specific human breast cancer cell lines that represent stages of breast cancer progression and associate the expression levels with the resistance of the different cell lines to Taxol. The selected cell lines were MDA MB 435S, MDA MB 231, MDA MB 436, MCF7 and T47D. In order to compare total HURP’s protein levels we performed Western blot analysis. Immunofluorescence analysis was performed to detect and quantify HURP’s spindle bound fraction in each cell line. Then we associated Taxol resistance with HURP expression in the selected cancer cell lines, using the WST-1 proliferation assay results from previous experiments. From both Western blot and Immunofluorescence analysis we observed that the metastatic cell lines MDA MB 231 and MDA MB 435S showed the highest expression levels, followed by the MCF7 and the MDA MB 436 cell lines. The T47D cell line showed the lowest HURP expression levels compared to the other cell lines, suggesting that the higher expression levels of HURP associate with more aggressive and tumorigenic phenotype. Higher expression levels of HURP also correlated with a stronger resistance to Taxol. However, there was an exception to this model, since the MDA MB 435S express elevated HURP levels but seem to be extremely sensitive to Taxol. Further experiments are needed to verify HURP expression in each cell line, as well as additional experiments where the expression of HURP is altered by different approaches, in order to understand the role of HURP protein in breast cancer development and its impact on Taxol resistance.
56 σ.
Δημοκρίτειο Πανεπιστήμιο Θράκης
