Development of electrochemical DNA biosensors using amplicons containing analogue bases or 5-methyl-cytosine interactions with proflavine

 
δείτε την πρωτότυπη σελίδα τεκμηρίου
στον ιστότοπο του αποθετηρίου του φορέα για περισσότερες πληροφορίες και για να δείτε όλα τα ψηφιακά αρχεία του τεκμηρίου*
κοινοποιήστε το τεκμήριο




2009 (EL)
Ανάπτυξη ηλεκτροχημικών DNA βιοαισθητήρων συνθετικών πολυνουκλεοτοδίων που περιέχουν ανάλογα βάσεων ή μεθυλιωμένη κυτοσίνη, αλληλεπιδράσεις με προφλαβίνη
Development of electrochemical DNA biosensors using amplicons containing analogue bases or 5-methyl-cytosine interactions with proflavine

Αλεξιάδου, Δέσποινα

Ο σκοπός της διατριβής αυτής είναι η ανάπτυξη ηλεκτροχημικών βιοαισθητήρων για τη μελέτη της μεθυλίωσης στο DNA. Ως μοντέλα μεθυλίωσης χρησιμοποιήθηκαν συνθετικά DNAs, προϊόντα της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR products-amplicons), τα οποία περιείχαν είτε φυσικές βάσεις, είτε ανάλογα βάσεων, είτε το φυσικό ανάλογο 5-μεθυλο-κυτοσίνη. Τα συνθετικά αυτά DNAs ακινητοποιήθηκαν στην επιφάνεια του ηλεκτροδίου, ώστε να μελετηθούν οι φυσικοχημικές ιδιότητές τους, καθώς και οι διαφοροποιήσεις στην αλληλεπίδρασή τους με την προφλαβίνη, η οποία είναι μία ένωση που παρεμβάλλεται στο DNA. Αρχικά επιτεύχθηκε η σύνθεση προϊόντων PCR αντικαθιστώντας τους τριφωσφορικούς εστέρες των φυσικών δεοξυνουκλεοζιτών με τριφωσφορικούς εστέρες της 5-μεθυλο-2΄-δεοξυ-κυτιδίνης (5m-dCTP), της 2΄-δεοξυ-ινοσίνης (dITP) και της 7-δεαζα-2΄-δεοξυ-γουανοσίνης κατά τη διάρκεια της PCR. Τα ανάλογα βάσεων ενσωματώθηκαν καλύτερα στα προϊόντα PCR, όταν 60% των φυσικών βάσεων αντικαταστάθηκε από τα ανάλογα βάσεων. Στη συνέχεια αναπτύχθηκαν ηλεκτροχημικοί βιοαισθητήρες ακινητοποιώντας στην επιφάνεια του ηλεκτροδίου προϊόντα PCR. Η εφαρμογή βολταμμετρίας διαφορικού παλμού αποδείχθηκε χρήσιμη για τη διάκριση ανάμεσα σε πρότυπα DNA συστήματα, την ύπαρξη ινοσίνης ή μεθυλο-κυτοσίνης. Η αλληλεπίδραση της προφλαβίνης με προϊόντα PCR διαφορετικής σύνθεσης (περιεκτικότητας σε GC, εξόνιο 5 και 6 του γονιδίου p53) και με προϊόντα PCR που περιείχαν ανάλογα βάσεων (5-μεθυλο-κυτοσίνη και ινοσίνη) μελετήθηκε χρησιμοποιώντας τους ηλεκτροχημικούς βιοαισθητήρες που αναπτύχθηκαν. Διαπιστώθηκε ότι η παρεμβολή της προφλαβίνης σχετίζεται με την περιεκτικότητα σε γουανοσίνη και με τη θερμική σταθερότητα των συνθετικών DNA συστημάτων, καθώς ήταν μεγαλύτερη στα προϊόντα με χαμηλή περιεκτικότητα σε γουανοσίνη και με χαμηλή θερμική σταθερότητα. Συνοψίζοντας όλα τα παραπάνω αποτελέσματα, η ηλεκτροχημική ανάλυση μπορεί να αποδειχτεί χρήσιμη για την ανίχνευση επιγενετικών τροποποιήσεων στο DNA
This thesis is focused on the development of electrochemical biosensors for studying methylation of DNA. Synthetic DNAs, PCR products (amplicons) containing natural bases or analogue bases or 5-methyl-cytosine were used as methylation models. These PCR products were immobilized on the electrode surface in order to study their physicochemical properties and their differences in the interaction with proflavine, which is an intercalator. PCR products (amplicons) containing at some percentage 5-methyl-cytosine, inosine and 7-deaza-guanosine were synthesized by substituting the native bases during PCR amplification. Analogue bases were most efficiently incorporated in amplicons when 60% of the natural bases were substituted by analogue bases. Electrochemical amplicon biosensors were developed by immobilizing on the electrode’s surface amplicons containing analogue bases and 5-methyl-cytosine. Differential pulse voltammetry was found to be useful in differentiating between model DNA systems containing inosine and methyl-cytosine. The interaction of proflavine with amplicons of different composition (GC content, exon 5 and exon 6 of gene p53) containing different base analogues (5-methyl-cytosine and inosine) was studied using amplicon biosensors. Proflavine intercalation correlated with the guanosine content and thermal stability of the synthetic DNA systems, being greater for amplicons of lower guanosine content and lower thermal stability. Considering the speed, simplicity of instrumentation, and low cost of this procedure, the above results show electrochemical analysis is promising for the identification of epigenetic modification of DNA

PhD Thesis / Διδακτορική Διατριβή
info:eu-repo/semantics/doctoralThesis

Χημεία, Αναλυτική
Chemistry, Analytic
Electrochemical DNA biosensors
Βιοχημεία
Amplicons
Biochemistry
Προκλαβίνη
5-μεθυλο-κυτοσίνη
Ηλεκτροχημεία
Προϊόντα PCR
Ηλεκτροχημικοί DNA βιοαισθητήρες
Ανάλογα βάσεων
Analogue bases
Electrochemistry
5-methyl-cytosine
Proflavine

Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης (EL)
Aristotle University of Thessaloniki (EN)

Ελληνική γλώσσα

2009
2010-01-04T07:49:54Z


Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης, Σχολή Θετικών Επιστημών, Τμήμα Χημείας

This record is part of 'IKEE', the Institutional Repository of Aristotle University of Thessaloniki's Library and Information Centre found at http://ikee.lib.auth.gr. Unless otherwise stated above, the record metadata were created by and belong to Aristotle University of Thessaloniki Library, Greece and are made available to the public under Creative Commons Attribution-ShareAlike 4.0 International license (http://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0). Unless otherwise stated in the record, the content and copyright of files and fulltext documents belong to their respective authors. Out-of-copyright content that was digitized, converted, processed, modified, etc by AUTh Library, is made available to the public under Creative Commons Attribution-ShareAlike 4.0 International license (http://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0). You are kindly requested to make a reference to AUTh Library and the URL of the record containing the resource whenever you make use of this material.
info:eu-repo/semantics/openAccess



*Η εύρυθμη και αδιάλειπτη λειτουργία των διαδικτυακών διευθύνσεων των συλλογών (ψηφιακό αρχείο, καρτέλα τεκμηρίου στο αποθετήριο) είναι αποκλειστική ευθύνη των αντίστοιχων Φορέων περιεχομένου.