Κατά τη διάρκεια των τριών προηγούμενων δεκαετιών, πολλά βήματα στην ανάπτυξη της αθηροσκλήρυνσης έχουν αναγνωριστεί και καταννοηθεί, σε κυτταρικό και μοριακό επίπεδο. Η αθηροσκλήρυνση είναι μια σύνθετη οντότητα, όπου το ενδοθήλιο και τα λεία μυϊκά κύτταρα των αγγείων, τα μακροφάγα, τα Τ-λεμφοκύτταρα και τα αιμοπετάλια αλληλεπιδρούν μεταξύ τους και παράγουν σε συνδυασμό μια απάντηση αγγειακής βλάβης. Χημειοτακτικοί παράγοντες που επηρεάζουν τη συσσώρευση των λευκοκυττάρων, μιτογόνοι και αυξητικοί παράγοντες που προκαλούν πολλαπλασιασμό του συνδετικού ιστού, των μακροφάγων, των ενδοθηλιακών και λείων μυϊκών κυττάρων, προκαλούν σχηματισμό αθηροσκληρυντικών αλλοιώσεων. Η παραγωγή και η πρόσληψη οξειδωμένων χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεϊνών (ox-LDL), από το ενδοθήλιο και τα μακροφάγα προκαλεί επιπρόσθετη βλάβη στα αγγειακά τοιχώματα, ενώ ο σχηματισμός μονοξειδίου του αζώτου (ΝΟ), ρυθμίζει τον αγγειοκινητικό τόνο. Ο σκοπός της παρούσας διατριβής αρχικά ήταν η διερεύνηση βλαβών στο επίπεδο του μικροδορυφορικού (microsatellite) DNA που εντοπίζονται κοντά ή εντός των χρωμοσωμικών περιοχών, στις οποίες χαρτογραφούνται γονίδια του MMR συστήματος του ανθρώπου, σε αθηρωματικούς ιστούς. Σε δεύτερη φάση, πραγματοποιήθηκε ευρύτερος έλεγχος δεικτών μικροδορυφορικού DNA προκειμένου να αναδυθούν γονίδια που σχετίζονται με την αθηροσκλήρυνση. Σε ό,τι αφορά το πρώτο σκέλος της μελέτης, διαπιστώθηκε ότι: α) οι γενετικοί τόποι hMSH2, hPMS1 και hMLH1 εμπλέκονται σε ποσοστό 28% με τη δημιουργία αθηρωματικών πλακών, β) το φαινόμενο της απώλειας της ετεροζυγωτίας ή ανισορροπίας αλληλομόρφου (loss of heterozygosity, LOH, or allelic imbalance, AI) ανιχνεύεται αρκετά συχνά στις αθηρωματικές πλάκες και γ) το κλάσμα της τοπικής απώλειας γενετικού υλικού (fractional regional loss, FRL) βρέθηκε να είναι 0,021, 0,021 και 0,026 αντίστοιχα στους προαναφερθέντες γενετικούς τόπους. Αυτές οι παρατηρήσεις φαίνεται να είναι το αποτέλεσμα εστιακού μονοκλονικού πολλαπλασιασμού γενετικά διακριτών λείων μυϊκών κυττάρων. Για να ξεκαθαρίσουμε τη σημασία των αλλαγών του DNA στην παθογένεια της αθηροσκλήρυνσης, προχωρήσαμε στο δεύτερο σκέλος της μελέτης και εξετάσαμε DNA από αθηρώματα αορτής για μικροδορυφορικές αλλαγές με δείκτες που σχετίζονται με τη νόσο. Συγκεκριμένα VIII αναλύθηκαν 78 νεκροτομικά αορτικά αθηρώματα για αλλαγές του μικροδορυφορικού DNA, έναντι αντίστοιχου φλεβικού αίματος. Για να εκτιμήσουμε τη σημασία αυτών των παρατηρήσεων, 33 επιπλέον φυσιολογικά ιστολογικά αορτικά δείγματα αντίστοιχης ηλικίας και φύλου εξετάστηκαν. Απώλεια της ετεροζυγωτίας (Loss of heterozygosity- LOH), βρέθηκε στο 47.4% των περιπτώσεων και στο 18.2% των μαρτύρων σε τουλάχιστον ένα γενετικό τόπο. Η εμφάνιση της απώλειας της ετεροζυγωτίας στον αορτικό ιστό σχετίζεται με τον κίνδυνο της αρτηριοσκλήρυνσης (OR 4,06, 95% CI 1,50 έως 10,93). Σημαντικές γενομικές αλλαγές βρέθηκαν στις περιοχές 1p32-p31, 1q22-q25, 2q35 και 6p21.3 όπου τα αντίστοιχα γονίδια VCAM1, SELE, APEG1 και AIF1 έχουν χαρτογραφηθεί. Συμπερασματικά, σε ό,τι αφορά το πρώτο σκέλος της μελέτης, η εμπλοκή γενετικών βλαβών στα γονίδια του MMR συστήματος στις αθηρωματικές αλλοιώσεις, φαίνεται πως είναι περιορισμένη. Ως προς το δεύτερο σκέλος, η εκτενής ανάλυση πολλαπλών γενετικών δεικτών, διάσπαρτων στο ανθρώπινο γονιδίωμα, σε αθηρωματικά και φυσιολογικά αγγεία, υποδεικνύει πως οι βλάβες στο γενετικό υλικό πράγματι αποτελούν παράγοντα κινδύνου για την αθηρογένεση. Ανεξαρτήτως της αιτιολογίας της δημιουργίας τους, είναι δυνατό να πλήξουν τη λειτουργία γονιδίων που ενέχονται στη φλεγμονώδη απόκριση, και στο μηχανισμό επούλωσης αγγειακού τραύματος. Με τον αποκλεισμό των σποραδικών γενετικών αλλοιώσεων που εντοπίζονται τυχαία σε φυσιολογικά αγγεία, απομονώνονται περιπτώσεις σε γονίδια που εμπλέκονται στην πρόσδεση των λευκοκυττάρων, την ανάπτυξη των αγγειακών λείων μυϊκών κυττάρων, τη διαφοροποίηση και μετανάστευσή τους. Τέτοιες γενετικές αλλοιώσεις ευννοούν τα λεία μυϊκά κύτταρα που τις φέρουν και βοηθούν στην κλωνική τους επέκταση και μετανάστευση.
(EL)
Over the past three decades many cellular and molecular steps of atherosclerosis development have been well recognized and understood. Atherosclerosis is a complex systemic condition where endothelium and vascular smooth muscle cells (VSMCs), macrophages, T-lymphocytes, and platelets interact with each other and produce in combination a vascular injury-like response. Chemotactic factors that affect leukocyte chemotaxis, mitogens and growth factors that cause proliferation of connective tissue, macrophages, VSMCs and endothelial cells, promote atherosclerotic lesion formation. Production and uptake of oxidized low-density lipoprotein (ox-LDL) by the endothelium and macrophages causes further injury to the vessel walls, while the formation of nitric oxide (NO) modulates vasomotor tone. The aim of this study, was initially to find out lesions at the level of microsatellite DNA located in the regions where the genes of the human mismatch repair system (MMR), are located. As a second step, we tested more microsatellite DNA markers, in order to find genes associated with atherosclerosis development. According to our first results, we found that: a) the genetic loci hMSH2, hPMS1 and hMLH1 are involved in atherosclerotic plaque formation at a 28%. b) loss of heterozygosity, LOH, or allelic imbalance,AI, is detected in atherosclerotic plaques and c) fractional regional loss, FRL, was 0,021, 0,021 and 0,026 in the forementioned genetic loci respectively. These observations seem to be the result of the focal monoclonal proliferation of genetically distinct VSMCs. To elucidate the potential importance of DNA alterations in the pathology of atherosclerosis we screened DNA from aortic atheromas for microsatellite alterations in markers previously associated with the disease. We assayed seventy eight aortic atheromas compared to correspondent venous blood DNA. Thirtythree histologically normal aortic tissues in comparison to their correspondent blood samples were also examined as a control group. LOH was found in 47,4% of atherosclerotic cases and in 18,2% of controls in at least one locus. The LOH incidence was found to be associated to atherosclerosis risk with an odds ratio value of 4,06, 95% CI 1,50 to 10,93. Comparison of the profiles of microsatellite DNA alterations between cases and controls revealed that 1p32-p31, 1q22-q25, 2q35 and 6p21.3 were significantly X affected in atherosclerotic cases (p<0,05). In these genomic regions VCAM1, SELE, APEG1 and AIF1 genes have been mapped respectively. In conclusion, as far as the first part of the study is concerned, the genetic lesions in MMR genes in atherosclerotic plaques, seem to be of not important interest. At the second part of the study, the detailed assay of multiple genetic loci of the human genome, shows that these genetic lesions form an atherosclerotic risk factor for atherosclerosis. Our data suggest that genomic rearrangements in atherosclerosis may be directly linked with disease development as an inflammatory vascular wound healing response. Genes involved in leukocyte adhesion, vascular smooth muscle cells growth, differentiation and migration, were found affected by somatic genomic alterations in atheromas and could provide the trigger to disease development. XI
(EN)
