Οι λεισμανιάσεις είναι μια ομάδα ασθενειών που προσβάλουν τον άνθρωπο και μερικά ζώα. Κατανέμονται σε όλες τις τροπικές και εύκρατες περιοχές του πλανήτη εκτός από την Αυστραλία. Η νόσος προκαλείται από το παράσιτο του γένους λεϊσμάνια (Protozoa: Trypanosomatidae) και μεταδίδεται από σκνίπες του γένους Phlebotomus (Diptera: Psychodidae). Έχουν ανιχνευθεί 21 είδη φλεβοτόμων που δρούν σαν ενδιάμεσοι ξενιστές και μπορούν να μολύνουν τον άνθρωπο και πολλά είδη ζώων (σκυλιά, σαρκοφάγα θηλαστικά, τρωκτικά και βραδύποδα) που με την σειρά τους χρησιμεύουν σαν υπόδοχα του παρασίτου. Η οικολογία και η επιδημιολογία καθιστά αναμφίβολα τις λεϊσμανιάσεις μια από τις πιο πολυμορφικές αρμπολοιμώξεις. Οι επιδημιολογικές μελέτες της λεϊσμανίασης περιλαμβάνουν την ταυτοποίηση του ενδιάμεσου ξενιστή, με βάση μορφολογικά χαρακτηριστικά. Η μεθοδολογία αυτή απαιτεί εξειδίκευση, εξ' αιτίας της διαφοροποίησης των ειδών που κρίνεται από λεπτά μορφολογικά χαρακτηριτικά. Άλλες μέθοδοι όπως μορφομετρικές, ισοενζυματική ηλεκτροφόρηση και χρήση ραδιενεργών DNA ανιχνευτών θέτουν περιορισμούς στην ευρεία χρήση τους ως πολύπλοκες και χρονοβόρες. Ετσι δημιουργείται η αναγκαιότητα της ανάπτυξης μοριακών τεχνικών για την τυποποίηση των φλεβοτόμων. Στο πρώτο μέρος αυτής της εργασίας περιγράφεται η ανάπτυξη μιας απλής και αξιόπιστης μεθόδου για την τυποποίηση των φλεβοτόμων. Βασίζεται στην ανίχνευση πολυμορφικών χαρακτήρων στην νουκλεοτιδική ακολουθία του 18S rDNA με την χρήση PCR και επιλεγμένων περιοριστικών ενζύμων. Χρησιμοποιήθηκαν 10 είδη φλεβοτόμων από την Ελλάδα και την Κύπρο που είχαν συλλεχθεί κατά την διάρκεια επιδημιολογικών και εντομολογικών μελετών. Παρατηρήθηκε η ύπαρξη συντηρημένων περιοριστικών θέσεων για κάθε είδος, που παράγουν συντηρημένα και ειδικά περιοριστικά προφίλ με την χρήση αντιστοίχων ενζύμων. Η μέθοδος εφαρμόστηκε και έδωσε ασφαλή αποτελέσματα ακόμα και σε έντομα των οποίων οι μορφολογικοί χαρακτήρες ήταν δυσδιάκριτοι, εξ' αιτίας λεπτών διαφορών, ή κακής συντήρησης. Είναι δε εφαρμόσημη σε όλα τα στάδια ανάπτυξης του εντόμου και όχι μόνον στο τέλειο ενήλικο άτομο. Η δυνατότητα ασφαλούς χρήσης της τεχνικής χωρίς την ύπαρξη εξειδικευμένων στην μορφολογική τυποποίηση ερευνητών, κάνει την μέθοδο εφαρμόσημη σε ευρεία κλίμακα στις έρευνες πεδίου. Για τις επιδημιολογικές μελέτες των αρμπολοιμώξεων είναι σημαντικό να μελετηθούν ταυτοχρόνως οι φυλογενετικές σχέσεις των ειδών του παθογόνου και του ενδιάμεσου ξενιστή καθώς και η αλληλεπίδρασή τους εν όψη της διερεύνησης των σύγχρονων εξελικτικών φαινομένων. Έτσι, η μελέτη προχώρησε πέρα από την ανίχνευση των πολυμορφικών περιοριστικών θέσεων του 18S rDNA για την τυποποίηση των φλεβοτόμων, στην ανάλυση των φυλογενετικών σχέσεων μεταξύ των διαφόρων ειδών. Η φυλογενετική ανάλυση διερευνά την εξελικτική πορεία των υπό μελέτην ειδών και πληροφορίες σχετικές με την ύπαρξη διακριτών υποπληθυσμών μπορεί να είναι επιδημιολογικά σημαντικές. Για την μελέτη αυτή χρησιμοποιήθηκαν 70 άτομα φλεβοτόμων που ανήκουν σε 15 είδη και 3 γένη και τα οποία περισυνελλέγησαν σε σταθμούς από την Ελλάδα και την Κύπρο. Στούς φλεβοτόμους οι σχέσεις αναλύθηκαν στο επίπεδο του υπο-γένους και του είδους. Τα αποτελέσματα ανέδειξαν το υπογένος Euphlebotomus να αποτελεί την βάση των υπογενών Larroussius και Adlerius. Αυτό το αποτέλεσμα έρχεται σε αντίθεση με τα αποτελέσματα φυλογενετικών μελετών με βάση τα μορφολογικά χαρακτηριστικά. Επιπλέον το αποτέλεσμα αυτό είναι επιδημιολογικά σημαντικό διότι σ' αυτά τα υπογένη ταξινομούνται τα περισσότερα είδη ενδιαμέσων ξενιστών του συμπλέγματος της Leishmania donovani. Τα επιδημιολογικά δεδομένα της λεισμανίασης έχουν αλλάξει τα τελευταία χρόνια, κυρίως στην περιοχή της Μεσογείου, όπου η ασθένεια ήταν παραδοσιακά ζωονόσος. Η λεισμανίαση θεωρείται σημαντική ευκαιριακή λοίμωξη, δεδομένου οτι μεγάλο ποσοστό ανοσοκατεσταλμένων ασθενών πάσχουν από την ασθένεια. Για τον λόγο αυτό οι ορολογικές διαγνωστικές μέθοδοι δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν με ασφάλεια και αποτελεσματικότητα. Μοριακές διαγνωστικές τεχνικές έχουν αναπτυχθεί και χρησιμοποιηθεί, στηρίζονται δε στον πολλαπλασιασμό και ανίχνευση ποικίλων τμημάτων DNA του παρασίτου. Με στόχο την ανάπτυξη μεθόδων που θα χρησιμοποιηθούν στην διάγνωση στον άνθρωπο αλλά και στον ενδιάμεσο ξενιστή αναπτύχθηκε, στο τρίτο μέρος αυτής της εργασίας, μια μέθοδος που βασίζεται στον πολλαπλασιασμό και ανίχνευση τμήματος DNA του μινικύκλου. Για την ανίχνευση του παρασίτου στον ξενιστή απαιτείται μεγάλη ευαισθησία, έτσι χρησιμοποιήθηκαν τρείς εναρκτές, σε δύο στάδια πολλαπλασιασμού, (semi- nested PCR) σε μία δοκιμασία που έχει την ικανότητα να ανιχνεύει 3 παράσιτα/ έντομο. Η μέθοδος χρησιμοποιήθηκε στα έντομα από την ενδημική περιοχή της Αττικής και τα αποτελέσματα έδειξαν μολυσμένα έντομα σε ποσοστό 6,2%. Έκπληξη ήταν η κατανομή των μολυσμένων εντόμων στα είδη: Στην Ελλάδα αποδεδειγμένος ενδιάμεσος ξενιστής είναι ο P. neglectus και πιθανός ο P. tobbi (υπογένος Larroussius). Μολυσμένοι όμως βρέθηκαν, εκτος των προανεφερθέντων, και τα είδη P. simici (υπογένος Adlerius) , P. alexandri και P. papatasi, είδη που δεν θεωρούνται ξενιστές. Αν και για τον P. papatasi δεν υπάρχουν άλλα στοιχεία που να υπονοεί τον ρόλο του ξενιστή, ο P. simici και P. alexandri είναι αποδεδειγμένοι ξενιστές της L. infantum και L. donovani αντίστοιχα στην Ασία. Με δεδομένη την στενή φυλογενετική σχέση των Larroussιus και Adlerius όπως περιγράφεται στο δεύτερο μέρος της εργασίας και των επιδημιολογικών δεδομένων μπορούμε να υποθέσουμε τον πιθανό ρόλο ξενιστή του P. simici και στην Ελλάδα. H συντονισμένη χρήση της μεθοδολογίας που περιγράφεται δίδει σημαντικές πληροφορίες για την ταυτοποίηση των μεταβιβαστών της λεϊσμάνιας, την ανίχνευση ενεργών ενδημικών περιοχών και την παρακολούθηση της "κυκλοφορίας" μολυσματικών στελεχών του παρασίτου στις ενδημικές περιοχές.
(EL)
The leishmaniases are a group of infectious diseases affecting humans, wild and domestic animals, and are distributed throughout all tropical and subtropical continents, except Australia. These diseases are caused by parasites of the genus Leishmania (Protozoa, Trypanosomatidae) and are transmitted by Phlebotomine sandflies (Diptera: Psychodidae). With 21 species of human-infective parasites, numerous reservoirs and vector species in a wide range of topographically different foci, the ecology and epidemiology of leishmaniases are without doubt the most diverse of all vector-borne diseases. Epidemiological studies of leishmaniasis begin with efforts to identify the vector. This is a difficult task that requires specialised training, since species are differentiated by minute morphological and anatomical traits, with character states often overlapping in related species. For this reason, and taking into account the limitations posed by all available methods (morphometrics, isoenzyme electrophoresis and radioactive DNA probes), the necessity of developing a new technique for typing of sandflies was manifested. In the first part of this work, a simple and reliable technique was developed to distinguish phlebotomine sandflies by restriction fragment length polymorphism of PCR-amplified (PCR-RFLP) small subunit (SSU) nuclear ribosomal DNA (rDNA). Specific patterns were obtained by double restriction digestion of amplified SSU rDNAs for all 10 sandfly species collected in Greece and Cyprus during epidemiological studies. Distinct RFLP profiles were also obtained for other three species that originated from Spain, India and Mexico. Furthermore, this methodology was successfully applied on sandflies for which morphological characters were badly distinguished due to minor differences between close species or to poor storage conditions, as well as on larval stage samples. This technique will allow the identification of sandfly species without the need of experts on insect morphological characters. During epidemiological studies of vector-borne diseases, it is very important to consider jointly the phylogenetic relationships among the different species, subspecies and strains of the pathogen, the host and the vector, and their interactions. Studying the impact of the genetic variability on the transmission and pathogenicity of leishmaniasis, it will be possible to explore in depth the coevolution phenomena of the links involved in the epidemiological transmission chain. For this purpose, the study progressed beyond PCR-RFLP sandfly identification to analyse phylogenetic relationships between the different species. Phylogenetic analysis explores the past of the species under study on an evolutionary scale, and can inform of possible isolation of sandfly populations, which is a critical aspect for the epidemiology of leishmaniasis. Relationships among 70 phlebotomine specimens (which belonged to 15 species and 3 genera) collected during epidemiological studies in Greece and Cyprus, were inferred from the phylogenetic analysis of SSU nuclear rDNA sequences, obtained by cloning of amplified full-length genes. Outgroups included 15 non-psychodid dipterans, and single representatives of 4 other insect orders. Within Phlebotominae, relationships were resolved at subgenus and species level. Subgenus Euphlebotomus appears to be the basal clade to Larroussius and Adlerius subgenera, which differs from previous morphological classifications. The significance of this observation becomes epidemiologically relevant since these three subgenera contain most of the Old World vectors of the Leishmania donovani complex. Data concerning epidemiology of leishmaniasis have changed during the last decades in the Old World, particularly in the Mediterranean Basin where visceral leishmaniasis was traditionally zoonotic. Leishmaniasis has become an opportunistic disease since immunocompromised patients, such as HIV patients, can serve as human reservoirs. Under these circumstances, suitable tools should be developed for the study of Leishmania epidemiology. Molecular assays for the diagnosis of leishmaniasis have been developed based on the amplification of several DNA targets, since the routine diagnostic techniques fail to detect infections in immunocompromised patients. Investigation of the possible similarities between insect and patient parasites is also very important for the epidemiological studies of leishmaniasis. The third part of the present study describes a semi-nested PCR assay for the detection of Leishmania within sandflies, which was developed based on the kinetoplastic minicircle sequence of Leishmania donovani. This methodology is more sensitive than the standard PCR since it is able to detect as few as 3 parasites per single naturally infected sandfly. Leishmania DNA was found in some samples of the species Phlebotomus neglectus (subgenus Larroussius), the only proven vector of L. infantum in Greece, and in other species, such as P. tobbi, P. simici, P. alexandri and P. papatasi. Phlebotomus tobbi, the other Larroussius species, is considered as a suspected vector of L. infantum, while the other three species (P. simici, P. alexandri and P. papatasi) have never been incriminated for the transmission of Leishmania in Greece. However, P. simici and P. alexandri are proven vectors of L. infantum and L. donovani respectively, in different regions of China. These facts, combined with the close genetic relationship shown for Larroussius and Adlerius subgenera, might suggest vectorial capacity of P. simici in Greece. The application of this technique is crucial for the identification of potential vector species and latent infections present in populations. In addition, it will permit the comparison of Leishmania DNA sequences amplified from sandfly vectors with those from patients, in order to investigate the transmission patterns of Leishmania in different endemic areas. Furthermore, the ability of these techniques to detect the presence of parasites in clinical samples, has proved useful for the diagnosis of leishmaniasis in immunocompromised patients as well as for the assessment of patients during therapy.
(EN)
