Μελέτη δομής και λειτουργίας γλουταμικής αφυδρογονάσης ειδικής για το νευρικό σύστημα

RDF 

 
Το τεκμήριο παρέχεται από τον φορέα :
Πανεπιστήμιο Κρήτης
Αποθετήριο :
E-Locus Ιδρυματικό Καταθετήριο
δείτε την πρωτότυπη σελίδα τεκμηρίου
στον ιστότοπο του αποθετηρίου του φορέα για περισσότερες πληροφορίες και για να δείτε όλα τα ψηφιακά αρχεία του τεκμηρίου*
κοινοποιήστε το τεκμήριο



Σημασιολογικός εμπλουτισμός/ομογενοποίηση από το EKT
2007 (EL)
Μελέτη δομής και λειτουργίας γλουταμικής αφυδρογονάσης ειδικής για το νευρικό σύστημα

Μαστοροδήμος, Βασίλειος Χρήστου

Καραγωγέως, Δόμνα
Πλαϊτάκης, Ανδρέας
Θερμού, Κυριακή

Η γλουταμική αφυδρογονάση (GDH), ένα ένζυμο με σημαίνοντα ρόλο στο μεταβολισμό του γλουταμικού, θεωρείται πως εντοπίζεται στα μιτοχόνδρια, μολονότι νεότερες μελέτες έδειξαν εντόπιση ισομορφής της GDH στο ενδοπλασματικό δίκτυο, στα λυσοσώματα, σε κυτταροπλασματικές μεμβράνες/κυστίδια ή ακόμη και στον πυρήνα. Στον άνθρωπο υπάρχει σε δύο ισομορφές. Η πρώτη (hGDH1) κωδικοποιείται από το γονίδιο GLUD1, το οποίο εκφράζεται σε όλους τους ιστούς (house-keeping), περιέχει 13 εξόνια και χαρτογραφείται στο ανθρώπινο χρωμόσωμα 10. Η δεύτερη (hGDH2) κωδικοποιείται από ένα φυλοσύνδετο μη περιέχων ιντρόνια γονίδιο (GLUD2), το οποίο εκφράζεται ειδικώς στο νευρικό σύστημα και στους όρχεις. Η wild type hGDH1είναι θερμοανθεκτική και έχει σημαντική βασική δραστηριότητα (40-45% της μεγίστης) απουσία αλλοστερικών τροποποιητών. Αναστέλλεται όμως ισχυρά από το GTP σε σχετικά χαμηλές συγκεντρώσεις GTP (IC50 = 0,3 μΜ), ανάλογες αυτών που υπάρχουν υπό φυσιολογικές συνθήκες στους μη νευρικούς ιστούς, καθιστώντας το GTP ρυθμιστή της δραστικότητας της GDH στους περιφερικούς ιστούς. Η wild type hGDH2 είναι θερμοασταθής, εμφανίζει χαμηλή βασική δραστηριότητα (5-10 % της μεγίστης) και δεν αναστέλλεται από το GTP, του οποίου τα επίπεδα στο νευρικό ιστό είναι υψηλότερα. Ενεργοποιείται πλήρως σε αυξημένες συγκεντρώσεις ADP και ως εκ τούτου λειτουργεί κυρίως όταν υπάρχει αυξημένη κατανάλωση κυτταρικής ενέργειας (υψηλά επίπεδα ADP), όπως επί έντονης διεγερτικής νευροδιαβίβασης. Επίσης η λευκίνη δρα ως αλλοστερικός ενεργοποιητής σε μεγαλύτερο ποσοστό της wild type hGDH2 απ’ ότι της wild type hGDH1, γεγονός που γίνεται εντονότερο παρουσία μικρών συγκεντρώσεων ADP (συνέργεια ADP και λευκίνης). Οι διαφορές των δύο ισοενζύμων μελετήθηκαν με μ μεταλλαξιογένεση σε θέσεις στις οποίες διαφέρουν και βρέθηκε πως δύο αντικαταστάσεις αμινοξέων ευθύνονται για τις σημαντικότερες διαφορές μεταξύ των wild type hGDH1 και wild type hGDH2. Η αντικατάσταση της Gly 456 από Ala προσδίδει την ανθεκτικότητα στο GTP. Η δεύτερη αντικατάσταση (Arg443 από Ser) ελαχιστοποιεί την βασική δραστικότητα (~3% της μεγίστης) αλλά επιτρέπει την πλήρη ενεργοποίηση του ενζύμου με ADP και επιπλέον αποτρέπει την ενεργοποίηση από τη λευκίνη. Παρουσία όμως μικρών συγκεντρώσεων ADP (0.025-0.1 mM) στις οποίες μόνο του το ADP ελάχιστα ενεργοποιεί το ένζυμο (<10 % της μεγίστης δραστηριότητας), παρατηρείται αύξηση της δραστηριότητας έως και >2,000 %. Τέλος η Arg443 φαίνεται πως είναι υπεύθυνη για την ευαισθησία στη θερμική αδρανοποίηση της wild type hGDH2. Η Arg443 βρίσκεται στην μικρή έλικα της κατερχόμενης αλυσίδας της antenna και συνδέεται με δεσμούς υδρογόνου με τη Ser 409 της ανερχόμενης α-έλικας της antenna γειτονικής υπομονάδας. Με σκοπό να εμβαθύνουμε περαιτέρω στον τρόπο ρύθμισης της wild type hGDH2 δημιουργήσαμε αρχικώς 2 μεταλλαγμένες ισομορφές με αντικατάσταση της Ser409 με Arg ή Asp. H Ser409Arg μεταλλαγμένη hGDH1 εμφάνισε πολύ χαμηλή βασική ειδική δραστηριότητα (2.7 % της μεγίστης), παρουσίαζε σημαντική ανθεκτικότητα στη δράση του ADP (SC50 =127.5±4.1 μM) και ήταν ανθεκτική στην ενεργοποίηση από λευκίνη απουσία ADP. Μολαταύτα η παρουσία χαμηλών συγκεντρώσεων ADP (25-100μΜ) ευαισθητοποιούσε το μεταλλαγμένο ένζυμο στη δράση της λευκίνης (συνεργική δράση ADP-λευκίνης). Υιοθετούσε δηλαδή την συμπεριφορά της μεταλλαγμένης Arg443Ser hGDH1 και προσομοιάζει στον τρόπο ενεργοποίησης της hGDH2. Μολαταύτα ήταν απρόσμενα ανθεκτική στη θερμική αδρανοποίηση (χρόνος ημίσειας ζωής = 239.7 min) και σημαντικά πιο ευαίσθητη σε σύγκριση με την wild type hGDH1 (αλλά και την Arg443Ser μεταλλαγμένη hGDH1) στην αναστολή από το GTP. Η Ser409Asp μεταλλαγμένη hGDH1 εμφάνιζε χαμηλή βασική δραστηριότητα (3-5 % της μεγίστης) και σημαντικά μικρότερη ανθεκτικότητα στην ενεργοποίηση από λευκίνη, ενώ διαπιστώνεται συνέργεια μεταξύ ADP και L- λευκίνης μόνο σε χαμηλές συγκεντρώσεις ADP. Ενεργοποιούνταν από το ADP με τρόπο ομοιάζοντα περισσότερο στη wild-type hGDH1 και εμφάνιζε ανθεκτικότητα στην αναστολή από το GTP προσεγγίζοντας τη συμπεριφορά της wild-type hGDH2. Τα ανωτέρω αποτελέσματα επιβεβαιώνουν πως η βασική αιτία της χαμηλής βασικής δραστηριότητας της wild-type hGDH2 οφείλεται στην αλληλεπίδραση της Arg443 μίας υπομονάδος με την Ser409 γειτονικής υπομονάδας μέσω δεσμών Η, που αποτελεί το κριτικό γεγονός για το άνοιγμα/κλείσιμο της καταλυτικής σχισμής. Επιπλέον επιβεβαιώνεται πως η λευκίνη συνδέεται εντός του ενεργού κέντρου και συνεπώς απαραίτητη συνθήκη για τη δράση της αποτελεί η διάνοιξη της καταλυτικής σχισμής, γεγονός που επιτελείται με την αλληλεπίδραση Arg443 και Ser409. Η διπλά μεταλλαγμένη R443S/G456A hGDH1 που κατασκευάσαμε αναπαρήγαγε τις διαφορές που παρατηρούνται μεταξύ hGDH1 και hGDH2. Συγκεκριμένα εμφάνισε χαμηλή βασική δραστηριότητα (0.25% της μεγίστης), ήταν ευαίσθητη στη θερμότητα με χρόνο ημίσειας ζωής = 16.5 minutes, ήταν ~3 φορές πιο ανθεκτική στην ενεργοποίηση από το ADP σε σχέση με την wild type hGDH2 και επέδειξε παρόμοια με την wild type hGDH2 συμπεριφορά στην ανθεκτικότητα αναστολής από το GTP παρουσία ADP, ενώ απουσία αλλοστερικού ενεργοποιητή ήταν 8 φορές ανθεκτικότερη στη δράση του. Συνοπτικά υιοθετούσε συμπεριφορά ενδιάμεση της Arg443Ser μεταλλαγμένης hGDH1 και της hGDH2 και παρότι η διπλά μεταλλαγμένη R443S/G456A hGDH1 αποτελεί την καλύτερη έως σήμερα προσομοίωση της wild-type hGDH2 δεν ταυτίζεται με αυτήν. Τέλος μελετήσαμε την υποκυτταρική εντόπιση της γλουταμικής αφυδρογονάσης με παροδική συν-διαμόλυνση των κυτταρικών σειρών COS 7, HeLa, CHO, HEK 293 και SH-SY5Y (κυττάρων νευροβλαστώματος) με το χιμαιρικό πλασμίδιο pEGFP-N3-GLUD1 (ή GLUD2) και με 3 πλασμιδιακούς φορείς τους pDsRed2-Μitο, pDsRed2-Nuc και pDsRed2-ER -δείκτες υποκυτταρικής εντόπισης για συγκεκριμένα κυτταρικά οργανύλλια (μιτοχόνδρια, πυρήνας και ενδοπλασματικό δίκτυο αντιστοίχως). Σε όλες τις κυτταρικές σειρές που εξετάστηκαν και οι δύο ισομορφές hGDH1 και hGDH2 εντοπίζονται κατά κύριο λόγο στα μιτοχόνδρια. Σε μικρότερο ποσοστό εντοπιζόταν στο ενδοπλασματικό δίκτυο ανθρώπινων σωματικών και νευρικών κυττάρων, ενώ δεν υφίσταται πυρηνική μορφή GDH. (EL)
Glutamate dehydrogenase (GDH), an enzyme central to glutamate metabolism, is located in the mitochondria. In addition, there is evidence for extramitochondrial localization of GDH. Human GDH exists in housekeeping (hGDH1) and nerve tissue-specific (hGDH2) isoenzymes encoded by the GLUD1 and the GLUD2 genes respectively, which differ markedly in their basal activity, allosteric regulation and thermal stability. hGDH2 is thermolabile, shows low basal activity that is fully restored by ADP albeit at higher concentrations than hGDH1, is more sensitive to L-leucine activation and to the synergistic effect of ADP and L-leucine and resistant to GTP inhibition. Site directed mutagenesis of GLUD1 revealed that replacement of Gly456 by Ala made the enzyme resistant to GTP without altering its regulation by ADP. In addition substitution of Ser for Arg443 (which lies in the antenna region of GDH) virtually abolished basal activity, made the enzyme extremely sensitive to heat inactivation and totally abrogated the activation of the enzyme by L-Leucine. However the presence of low concentrations of ADP (0.025- 0.1 mM) permitted the activation of the mutant by L-leucine. Structural modeling implicated that the replacement of Arg443 by Ser may disrupt the H-bond(s) between Arg443 and Ser409 (part of the ascending strand of the antenna) from an adjacent subunit and thus may result in closure of the active catalytic cleft. Substitution of the Ser409 for Arg rendered the enzyme virtually inactive at baseline and resistant to Lleucine activation. ADP fully restored the activity of mutant and made it sensitive to L-leucine activation. On the other hand, replacement of Ser409 by Asp had a lesser effect on basal activity and to L-leucine activation than Arg substitution. Hence, these data confirm that interaction of adjacent subunits through the Arg443 and Ser409 residues plays a crucial role in setting the basal activity levels. Abrogation of Lleucine activation by R443S, S409R or S409D mutants is consistent with the concept that these mutations lead to a closed conformation, which hinders access of L-leucine to the catalytic site for it action. Since the S409R hGDH1 mutant was insensitive to heat denaturation, the interaction between the two residues does not seem to be responsible for heat sensitivity. In addition both S409R and S409D hGDH1 mutants showed a differential response to GTP inhibition, with the former being more sensitive and the latter more resistant to GTP in comparison to the wt hGDH1. Moreover, we created a double hGDH1 mutant that had both Arg443Ser and Gly456Ala in the same polypeptide chain. Functional analyses revealed that the doubly mutated enzyme had similar properties but did not acquire all the characteristics of the wild-type hGDH2. Subcellular localization studies were performed using expression vectors for hGDH1 and hGDH2 fused with the enhanced green fluorescence protein (EGFP) that transiently transfected COS 7, HeLa, CHO, HEK 293 and neuroblastoma cell lines. When the cultured cells were transfected with EGFP-tagged hGDH1 or hGDH2, confocal microscopy demonstrated localization of the fluorescence in the cytoplasmic region within coarse structures resembling mitochondria. Co-transfection experiments using a mixture of hGDH1-EGFP (or hGDH2-EGFP) vector and the pDsRed2-Mito vector (a mitochondrial marker) showed an identical fluorescence pattern in merged pictures, thus confirming the mitochondrial localization of both human GDHs. In addition, a small fraction of the hGDH1 (or hGDH2) was found to co-localize with endoplasmic reticular marker pDsRed2-ER. There was no evidence for the nuclear or cytoplasmic localization of either GDH isoforms. Our results elucidate further the properties that allow the brain isoenzyme to function well under the special conditions prevailing in the human Central Nervous System. (EN)

text

Νευρικό σύστημα
Nervous System
Δεϋδρογονάση γλουταμικού
Glutamate Dehydrogenase

Πανεπιστήμιο Κρήτης (EL)
University of Crete (EN)

2007-12-14




*Η εύρυθμη και αδιάλειπτη λειτουργία των διαδικτυακών διευθύνσεων των συλλογών (ψηφιακό αρχείο, καρτέλα τεκμηρίου στο αποθετήριο) είναι αποκλειστική ευθύνη των αντίστοιχων Φορέων περιεχομένου.