FTIR και Time Resolved Step-Scan FTIR Μελέτη της Κυτοχρωμικής Οξειδάσης ba3 από τον οργανισμό Thermus Thermophillus

This item is provided by the institution :

Repository :
E-Locus Institutional Repository
see the original item page
in the repository's web site and access all digital files if the item*

2004 (EN)
FTIR και Time Resolved Step-Scan FTIR Μελέτη της Κυτοχρωμικής Οξειδάσης ba3 από τον οργανισμό Thermus Thermophillus

Γιαλού, Ειρήνη
Gialou, Irene

Βαρώτσης, Κωνσταντίνος

Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η φασματοσκοπική μελέτη της κυτοχρωμικής οξειδάσης ba3 από το βακτήριο Thermus Thermophillus. Η οξειδάση ba3 ανήκει στην οικογένεια των χαλκοξειδασών και εμφανίζει αρκετές ομοιότητες με τα άλλα μέλη της ομάδας αλλά και ορισμένες ιδιαιτερότητες. Το ενεργό κέντρο του ενζύμου απαρτίζεται από μια αίμη τύπου α3 και ένα άτομο CuB, ενώ περιέχει και επιπλέον δύο ακόμη οξειδοαναγωγικά κέντρα: μια αίμη τύπου b και ένα διπυρηνικό κέντρο ατόμων CuA. Eκτός της ικανότητας αναγωγής του οξυγόνου προς νερό και της άντλησης πρωτονίων δια μέσου της εσωτερικής μιτοχονδριακής μεμβράνης, έχει πρόσφατα διαπιστωθεί ότι κατέχει επιπλέον την ικανότητα αναγωγής του μονοξειδίου του αζώτου προς οξείδιο του διαζώτου, υπό αναγωγικές αναερόβιες συνθήκες. Η παρούσα μελέτη πραγματοποιήθηκε κυρίως με την χρήση των τεχνικών FTIR και Time Resolved Step-Scan FTIR, με σκοπό την ταυτοποίηση τόσο των δομικών όσο και των δυναμικών χαρακτηριστικών του ενζύμου. Η φασματοσκοπία υπερύθρου αποδεικνύεται ιδιαίτερα αποτελεσματική σε αυτούς του τομείς, καθώς η υψηλή της ευαισθησία, η μεγάλη φασματική διακριτική ικανότητα αλλά και η μεγάλη χρονική ανάλυση των χρονοεξαρτώμενων πειραμάτων επιτρέπουν την ανίχνευση μεταβατικών δομικών αλλαγών ακόμη και ενός μεμονωμένου πρωτεϊνικού καταλοίπου. Η διεξαγωγή των πειραμάτων πραγματοποιήθηκε με την χρήση του σταθερού συμπλόκου του ανηγμένου ενζύμου με το μονοξείδιο του άνθρακα. Στο σύμπλοκο ισορροπίας βρέθηκε πως το 30% περίπου του δεσμευμένου CO παραμένει στον CuB, του οποίου το πρωτεϊνικό περιβάλλον εμφανίζει μεγάλη σταθερότητα στις αλλαγές pH και pD, παρατηρήσεις οι οποίες έρχονται σε συμφωνία με δημοσιευμένες μελέτες. Φωτολύοντας το σύμπλοκο ο υποκαταστάτης που αρχικά είναι δεσμευμένος στην σίδηρο της αίμης α3 μεταναστεύει μεταβατικά στον CuB , όπου παραμένει για λίγα ms. Η ανίχνευση του προϊόντος της φωτόλυσης του συμπλόκου ba3-CO σε φάσματα συνεχούς φωτόλυσης προσφέρει πληροφορίες για την δευτεροταγή δομή του ενζύμου και επιτρέπει την ταυτοποίηση δονήσεων πρωτεϊνικών ομάδων οι οποίες επηρεάζονται από την διαδικασία της φωτόλυσης. Η μελέτη της δυναμικής του ενζύμου επιτυγχάνεται μέσω των Time Resolved Step-Scan FTIR φασμάτων, τα οποία επιβεβαίωσαν την αργή κινητική του συμπεριφορά σε σχέση με άλλες οξειδάσες. Ανιχνεύοντας τις αντιδράσεις της πρωτεΐνης μετά την φωτόλυση του CO από τον αιμικό σίδηρο, προέκυψε ότι η μεταβατική δέσμευση του CO στον CuB είναι δυναμικά συζευγμένη με αλλαγές στην προπιονική ομάδα του πυρρολικού δακτυλιου Α της αίμης a3 και με αλλαγές στο τοπικό περιβάλλον των ασπαρτικών καταλοίπων D372. Σύμφωνα με την χρονική εξέλιξη των δονήσεων αυτών των ομάδων, οι οποίες συμμετέχουν σε μια από τις προτεινόμενες διαδρομές πρωτονίων διαμέσου της μεμβράνης, προκύπτει το συμπέρασμα πως η συμμετοχή των πρωτονιομένων ασπαρτικών καταλοίπων στην παρατηρούμενη αλλαγή τερματίζεται νωρίτερα από την συμμετοχή των αποπροτονιωμένων μορφών τους και των προπιονικών ομάδων. Η διαταραχή του ασπαρτικού καταλοίπου συνδέεται με τον σχηματισμό του μεταβατικού συμπλόκου και όχι με την επαναφορά του υποκαταστάτη στον σίδηρο της αίμης α3. Οι κινήσεις της πρωτεΐνης στην περιοχή των προπιονικών ομάδων και του γειτονικού Asp372 πραγματοποιούνται με τέτοιο τρόπο ώστε να μεταβάλλεται το δίκτυο τον δεσμών υδρογόνου των παραπάνω ομάδων. Με βάση τα φασματοσκοπικά δεδομένα και την συμμετοχή αυτών των ομάδων σε ένα από τα κανάλια μεταφοράς πρωτονίων, το οποίο καταλήγει σε μια περιοχή συσσώρευσης μορίων νερού, προτείνεται ένα μοντέλο για τον ρόλο του Asp372 και των προπιονικών ομάδων της αίμης α3 στην μετακίνηση πρωτονίων, στο οποίο δρουν ως ένας μοριακός διακόπτης ο οποίος ενεργοποιείται με την κοινή κατοχή ενός πρωτονίου. (EL)
The aim of the present study was the spectroscopic investigation of cytochrome ba3 from Thermus Thermophillus. Cytochrome ba3 is a member of the large family of heme-copper oxidases, which appears to have many similarities with other members of the group but reveals a number of unusual features as well. The active cite of the enzyme consists of a high spin heme a3 and a CuB atom. Based on the crystal structure, ba3 contains two more redox centers: a low spin heme b and homobinuclear CuA center. Besides it’s ability to catalyze the four electron reduction of O2 to H2O and to pump protons through the inner mitochondrial membrane, it has been recently reported that ba3¬ is also capable of reducing nitric oxide (NO) to nitrous oxide (N2O), under reducing anaerobic conditions. In the present study we have applied FTIR and Time Resolved Step-Scan FTIR spectroscopy to investigate the structural and dynamic characteristics of cytochrome oxidase ba3. Due to it’s high sensitivity, spectral and time resolution FTIR spectroscopy allows the detection of transient structural changes even of an individual protein residue and is proven to be a very powerful tool in the study of biological systems. Experiments were carried out using the stable complex of the reduced enzyme with CO. The study of the equilibrium complex suggests that almost 30% of bound CO remains bound to CuB. The protein environment of CuB shows great stability to pH or pD changes, results that come in agreement with published studies. By photolysing the heme-Fe-CO complex, CO migrates to CuB, where it remains for a few milliseconds. Detection of the photolysis product in continuous photolysis spectra reveals information for the secondary structure of the protein and allows the identification of vibrational modes of protein groups that are influenced by the photolysis process. The study of the protein dynamics and the dynamics of the active center was achieved by the Time Resolved Step-Scan FTIR spectrums that confirmed the slow kinetic behavior of cytochrome ba3 compared to other members of the oxidase family. By detecting the protein reactions to CO photolysis from the heme iron, it was concluded that the transient binding of CO to CuB is dynamically linked to structural changes at the ring A propionate of heme a3 and the to changes in the local environment of Asp372. These groups belong to the proposed Q proton channel and the time evolution of the vibrational modes that are attributed to them, indicates that the participation of the protonated form of the aspartic residue terminates sooner than the participation of it’s deprotonated form and of the propionic groups. The perturbation of Asp372 is related to the formation of the transient complex and not to the ligand recombination to the iron of heme a3. The protein motions in the region of the propionic groups and the nearby Asp372 are performed in a way that alters the hydrogen bond network of these groups. Based on the spectroscopic data and the participation of these groups in a proton pathway which, terminates at an accumulation of water molecules, a model is proposed for their role in proton movement. (EN)

Τύπος Εργασίας--Μεταπτυχιακές εργασίες ειδίκευσης



Σχολή/Τμήμα--Σχολή Θετικών και Τεχνολογικών Επιστημών--Τμήμα Χημείας--Μεταπτυχιακές εργασίες ειδίκευσης

*Institutions are responsible for keeping their URLs functional (digital file, item page in repository site)