Σκοπός του προτεινόμενου ερευνητικού έργου ήταν να διερευνηθεί η συσχέτιση της έκφρασης των μορίων του σηματοδοτικού μονοπατιού Notch, στην παθοφυσιολογία και αιτιοπαθογένεια της προεκλαμψίας.
Η προεκλαμψία εμφανίζεται στο 3-5% των κυήσεων και μπορεί να έχει σοβαρές επιπτώσεις στην υγεία της μητέρας και στην ανάπτυξη του εμβρύου. Πρόκειται για μία νόσο που χαρακτηρίζεται από αύξηση της αρτηριακής πίεσης μετά την 20η εβδομάδα της κύησης σε συνδυασμό με πρωτεϊνουρία ή/και οίδημα. Παρόλο που καταστάσεις όπως παχυσαρκία, χρόνια υπέρταση, διαταραχές πηκτικότητας, ανοσολογικά αίτια, γενετική προδιάθεση, διαιτητικές ανεπάρκειες ή καταχρήσεις φαίνεται να αποτελούν επιβαρυντικούς παράγοντες και έχουν συνδεθεί με την εμφάνιση της νόσου, οι μοριακοί μηχανισμοί και άλλα υποκείμενα αίτια που σχετίζονται με την παθοφυσιολογία της νόσου παραμένουν υπό διερεύνηση. Σύμφωνα με τους παράγοντες κινδύνου εμφάνισης προεκλαμψίας θα μπορούσε κανείς να συμπεράνει ότι υπάρχει μία αλληλοεπικάλυψη με τους αντίστοιχους παράγοντες εμφάνισης καρδιαγγειακών νοσημάτων. Το γεγονός αυτό επιβεβαιώνει ότι πρόκειται για νόσο που επιδρά στη παθοφυσιολογία του ενδοθηλίου των αγγείων. Επιπλέον, γυναίκες που εμφανίζουν προεκλαμψία, ειδικά και στη δεύτερη κύηση, εμφανίζουν επίσης υψηλοτέρα ποσοστά εμφάνισης καρδιοαγγειακών νοσημάτων στην μετέπειτα ζωή τους.
Οι πρωτεΐνες Notch (Notch-1 έως Notch-4) είναι μία οικογένεια ενδομεμβρανικών υποδοχέων οι οποίες δομικά και λειτουργικά παραμένουν συντηρημένες κατά την εξέλιξη. Ενεργοποιούνται από τους συνδέτες τους Delta (DLL-1,-3,-4) και Jagged/Serrate (Jagged-1,-2). Η σύνδεση του Notch με τον συνδέτη του οδηγεί σε πρωτεόλυση του υποδοχέα Notch από το ένζυμο γ-secretase. Το ενδοκυττάριο μέρος του Notch (Notch Intracellular Domain- NICD)
- 2 -
μεταναστεύει στον πυρήνα, όπου αλληλεπιδρά με την πρωτεΐνη RBP-Jκ. Στη συνέχεια το σύμπλοκο αυτό προσδένεται στο DNA και επάγει την έκφραση των γονιδίων στόχων του μονοπατιού Notch. Είναι ήδη γνωστό ότι το σηματοδοτικό μονοπάτι Notch έχει την ικανότητα να επηρεάζει την τύχη των κυττάρων μέσω της ενεργοποίησης μεταγραφικών παραγόντων, οι οποίοι αλλάζουν την έκφραση γονιδίων στόχων.
Μία από τις σημαντικότερες διαδικασίες κατά την εξέλιξη μιας κύησης είναι η φυσιολογική δημιουργία της εμβρυοπλακουντιακής μονάδας, που ξεκινάει με τη διείσδυση της κυτταροτροφοβλάστης στο ενδομήτριο, ενώ στη συνέχεια ολοκληρώνεται με τη συνένωση με τα μητριαία σπειροειδή αγγεία. Κατά τη διάρκεια της διαδικασίας αυτής απαιτούνται δομικές αλλαγές τόσο στο ενδοθήλιο του ενδομητρίου που υποδέχεται την κυτταροτροφοβλάστη, όσο και στα μυϊκά κυρίως τοιχώματα των μητριαίων σπειροειδών αρτηριών με σκοπό τη δημιουργία των χοριακών λαχνών. Κατά την ανάπτυξη του ανθρώπινου πλακούντα τα τροφοβλαστικά κύτταρα διαφοροποιούνται μέσω δυο μεγάλων μονοπατιών. Το villous pathway κατά το οποίο τα τροφοβλαστικά κύτταρα συγχωνεύονται για να σχηματιστούν τα συνκυτιοτροφοβλαστικά. Το extravillous pathway όπου τα τροφοβλαστικά κύτταρα διαφοροποιούνται α) σε interstitial extravillous trophoblasts τα οποία εισβάλλουν στο φθαρτό και σε ένα τμήμα του μυομητρίου ή β) σε edovascular extravillous trophobalsts (EVTs) τα οποία διαμορφώνουν την μητρική αγγειογένεση. Τα δυο αυτά στάδια διαφοροποίησης ελέγχονται σχεδόν εξολοκλήρου από την ένταση του οξυγόνου, μεταγραφικούς παράγοντες, ορμόνες, αυξητικούς παράγοντες και άλλα σηματοδοτικά μόρια. Ανώμαλη πλακουντοποίηση και συγκεκριμένα περιορισμένη εμφύτευση των τροφοβλαστικών κυττάρων στη μήτρα και αποτυχία του σχηματισμού των μητρικών αγγείων, θεωρείται ότι οδηγούν σε προεκλαμψία.
Μέλη του σηματοδοτικού μονοπατιού Notch εκφράζονται στον πλακούντα και παίζουν σημαντικό ρόλο στις παραπάνω αναπτυξιακές διαδικασίες. Το σηματοδοτικό μονοπάτι Notch ελέγχει την εμβρυική αγγειογένεση και την ανάπτυξη του μητρικού κυκλοφορικού συστήματος.
- 3 -
Στον τελειόμηνο ανθρώπινο πλακούντα, ο υποδοχέας Notch-2 και ο συνδέτης Jagged-2 συμμετέχουν στην αγγειογένεση. Εξάλειψη του Notch-2 σε ποντίκια είχε σαν αποτέλεσμα τη μείωση της αιμάτωσης του πλακούντα και της αρτηριακής διείσδυσης των τροφοβαστικών κυττάρων. Τα παραπάνω προτείνουν μια πιθανή σχέση ανάμεσα στο σηματοδοτικό μονοπάτι Notch και την προεκλαμψία. Το ενδοκυττάριο μέρος του υποδοχέα Notch (NICD) ενεργοποιεί τη μεταγραφή πολλών γονιδίων στόχων με σημαντικότερα μεταξύ αυτών τα Hey-1 και Hey-2, τα οποία είναι απαραίτητα για την αγγειακή ανάπτυξη. Τα γονίδια αυτά εκφράζονται κατά τη δημιουργία του αγγειακού συστήματος, στην καρδιά, στα ενδοθηλιακά κύτταρα αλλά και στον πλακούντα. Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι απενεργοποίηση των γονιδίων αυτών οδηγεί σε ανεπάρκεια των αγγείων του πλακούντα.
Στην παρούσα μελέτη πλακουντιακός ιστός έχει συλλεχθεί από 20 κυήσεις που εμφάνισαν προεκλαμψία και από 20 κυήσεις με ομαλή πορεία της εγκυμοσύνης. Η παρουσία προεκλαμψίας επιβεβαιώθηκε με κλινικό-εργαστηριακά και υπερηχογραφικά κριτήρια, ενώ αποκλείστηκαν οι περιπτώσεις προεκλαμψίας που αποδίδονται σε συγκεκριμένη νοσολογική οντότητα (θρομβοφιλία, ανοσολογικά και γενετικά αίτια, λοιμώξεις κ.ά). Για τον προσδιορισμό της έκφρασης των υπό εξέταση γονιδίων (Notch1-4; DLL-1,-3,-4; Jagged-1,-2; Hey-1,-2) έγινε αρχικά εξαγωγή εκχυλίσματος RNA, σύνθεση cDNA και στη συνέχεια Real-Time PCR, ενώ για τον προσδιορισμό της ποσότητας του ενδοκυττάριου τμήματος των υποδοχέων Notch (NICD1-4) έγινε εκχύλιση πρωτεϊνών από τους ιστούς και στη συνέχεια Western blot με κατάλληλα αντισώματα για την κάθε πρωτεΐνη. Η ανάλυση για την εξαγωγή στατιστικής σημαντικότητας μεταξύ των υπό εξέταση δεικτών και των κλινικών παραμέτρων πραγματοποιήθηκε με τη χρήση των κατάλληλων στατιστικών δοκιμασιών (Chi-square, KruskalWallis, Spearman rank correlation, κ.α.) του λογισμικού πακέτου SPSS.
Τα αποτελέσματα μας έδειξαν ότι οι υποδοχείς Notch-1 και Notch-4 αλλά και ο συνδέτης Dll-1 δεν εκφράζονται στους πλακούντες γυναικών με προεκλαμψία ή με φυσιολογική
- 4 -
εγκυμοσύνη. Το εύρημα αυτό συμφωνεί με προηγούμενη μελέτη στην οποία δεν βρέθηκε έκφραση της πρωτεΐνης Notch-1 στα τροφοβλαστικά κύτταρα του πλακούντα γυναικών με προεκλαμψία αλλά και με φυσιολογική κύηση, ενώ τα επίπεδα της πρωτεΐνης Notch-4 ήταν αρκετά μειωμένα στα εξωλαχνιακά τροφοβλαστικά κύτταρα. Ωστόσο, άλλες μελέτες έδειξαν ότι το Notch-1 και το Notch-4 εκφράζονται στον πλακούντα. Κάποιες από τις πιθανές εξηγήσεις για τις διαφοροποιήσεις αυτές είναι οι διαφορετικές πειραματικές μέθοδοι που χρησιμοποιήθηκαν στην κάθε μελέτη αλλά και το τμήμα του ιστού που αναλύθηκε αφού η έκφραση του μονοπατιού Notch αλλάζει καθώς τα τροφοβλαστικά κύτταρα διαφοροποιούνται. Ωστόσο, τα υπόλοιπα οκτώ γονίδια παρουσίασαν σημαντική μείωση έκφρασης σε γονιδιακό επίπεδο στα δείγματα προεκλαμψίας σε σχέση με τα φυσιολογικά δείγματα. Επιπλέον, το ενδοκυττάριο μέρος των υποδοχέων Notch-2 (NICD-2) και Notch-3 (NICD-3) ήταν υποεκφρασμένο σε επίπεδο πρωτεΐνης στα παθολογικά δείγματα, σε σχέση με τα φυσιολογικά. Το αποτέλεσμα αυτό επαληθεύεται από τα μειωμένα επίπεδα mRNA των υποδοχέων Notch-2 και Notch-3 στα δείγματα προεκλαμψίας. Προηγούμενη μελέτη έδειξε σημαντική μείωση στα επίπεδα των πρωτεϊνών Notch-2 και Jag-2 σε ανθρώπινους τελειόμηνους πλακούντες γυναικών που εμφάνισαν ενδομήτρια υπολειπόμενη ανάπτυξη ή υπέρταση κατά τη διάρκεια της εγκυμοσύνης τους, σε σχέση με τις φυσιολογικές κυήσεις. Επιπλέον, τα αποτελέσματα μας έδειξαν ότι τα γονίδια στόχοι Hey-1 και Hey-2 είχαν μειωμένη έκφραση mRNA στα δείγματα προεκλαμψίας σε σχέση με τα φυσιολογικά δείγματα. Η μειωμένη αυτή έκφραση πιθανόν να οφείλεται στη συνολικά μειωμένη έκφραση του σηματοδοτικού μονοπατιού Notch, ως μηχανισμός επαγωγής τους. Περαιτέρω ανάλυση ανέδειξε σημαντικές στατιστικά συσχετίσεις μεταξύ των πλακουντιακών επιπέδων mRNA και πρωτεΐνης και συγκεκριμένων παθολογικών παραμέτρων στις περιπτώσεις προεκλαμψίας. Ιδιαίτερο εύρημα ήταν η μη έκφραση του υποδοχέα Notch-3 στις εγκύους εκείνες που κάπνιζαν και στη διάρκεια της εγκυμοσύνης σε σχέση με εκείνες που το έκοψαν. Στις περιπτώσεις με προεκλαμψία και βάρος νεογνού μικρότερο από την 5η εκατοστιαία θέση παρατηρήσαμε υψηλότερα επίπεδα πρωτεΐνης του NICD-3 και υψηλότερα επίπεδα mRNA
- 5 -
του Dll-3 συγκρινόμενα με εκείνες τις περιπτώσεις προεκλαμψίας με βάρος νεογνού μεγαλύτερο
από την 5η εκατοστιαία θέση. Ένα άλλο εύρημα ήταν ότι η έκφραση του γονιδίου στόχος Hey-2
στους πλακούντες από τις εγκυμοσύνες με προεκλαμψία που ο τοκετός έγινε με καισαρική τομή
ήταν αυξημένη συγκρινόμενη με τις περιπτώσεις του κολπικού τοκετού. Επιπλέον, το Hey-2 είχε
αυξημένα επίπεδα έκφρασης στις γυναίκες με προεκλαμψία οι οποίες ήταν πρωτότοκες
συγκρινόμενες με αυτές που γέννησαν το δεύτερο ή το τρίτο παιδί τους. Στη συνέχεια, ελέγξαμε
το μοτίβο συνέκφρασης των ανωτέρω οκτώ γονιδίων σε συνδυασμό ζευγών. Στα φυσιολογικά
δείγματα πλακούντα, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το Notch-3 έχει θετική συσχέτιση με το
Notch-2. Ο υποδοχέας Dll-4 έχει θετική συσχέτιση με τους υποδοχείς Notch-2 και Notch-3 και
με τους συνδέτες Jagged-1, Jagged-2 και Dll-3. Ο υποδοχέας Jagged-1 είχε θετική συσχέτιση με
τον Notch-3 και με τον Jagged-1. Το γονίδιο στόχος Hey-1 συσχετιζόταν θετικά με τους συνδέτες
Jagged-1, Jagged-2 και Dll-4. Τελος, το Hey2 δεν συνεκφραζόταν με κανένα από τα άλλα μόρια
όσον αφορά τα επίπεδα έκφρασης. Στους πλακούντες των γυναικών με προεκλαμψία
παρατηρήσαμε περισσότερες και διαφορετικές συνεκφράσεις ανάμεσα στα μελετώμενα γονίδια
σε σχέση με τα φυσιολογικά δείγματα. Συγκεκριμένα, οι θετικές συσχετίσεις του υποδοχέα
Notch-3 με τον Notch-2 και του συνδέτη Dll-4 με τον Jagged-1 χάθηκαν στα δείγματα με
προεκλαμψία. Επιπλέον, οι συνδέτες Jagged-1 και Jagged-2 δεν συνεκφράζονταν με τον
υποδοχέα Notch-3 αλλά με τον Notch-2. Το Hey-1 σχετιζόταν επιπλέον με τα Notch-2 και Dll-3,
και το Hey-2 είχε θετική συσχέτιση και με τα υπόλοιπα 7 γονίδια. Η διαφορετική αλληλεπίδραση
του Hey-2 με τα υπόλοιπα μόρια του μονοπατιού Notch στους πλακούντες προεκλαμψιας σε
σχέση ε τους φυσιολογικούς, θα μπορούσε να δείξει ότι παίζει έναν σημαντικό ρόλο στην
ανάπτυξη και στην εξέλιξη της προεκλαμψίας, ένα συμπέρασμα που απιτεί περαιτέρω
διερεύνηση.
Τα ευρήματα μας αποδεικνύουν ότι το σηματοδοτικό μονοπάτι Notch αποτελεί
σημαντικό μέρος της παθογένειας αυτής της επιπλοκής της εγκυμοσύνης. Παρ’όλα αυτά
απαιτούνται περαιτέρω μελέτες για τους υποδοχείς Notch, τους συνδέτες τους και τα γονίδια
- 6 -
στόχους τους, ώστε να προσδιοριστεί κατά πόσο ένα ή περισσότερα μέλη του σηματοδοτικού αυτού μηχανισμού θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ως δείκτες για την έγκαιρη διάγνωση της προεκλαμψίας ή για νέες προληπτικές και θεραπευτικές στρατηγικές
(EL)
Preeclampsia (PE) affects 3-5% of all pregnancies worldwide and is a major cause of maternal mortality and morbidity. PE is a consequence of diverse pathological processes involving impaired implantation, endothelial dysfunction and systemic inflammation, and it is characterized by hypertension and proteinuria during pregnancy.
The Notch signaling pathway is an evolutionarily conserved intercellular signaling mechanism, which is involved in cell fate decisions and pattern formation during development. NOTCH1-4 receptors are single-pass transmembrane proteins that are activated by Delta (DLL1,-3,-4) and Jagged/Serrate (JAG1,-2) ligands. Each of these proteins shows cell-type- and tissue-specific expression during development. This ligand-receptor interaction leads to the proteolytic cleavage and release of the NOTCH intracellular domain (NICD), which translocates to the nucleus, where it interacts with the DNA with the help of transcription factor RBPJK, inducing the expression of numerous target genes. Members of the Notch signaling pathway have been detected in the developing placenta, where they play an important role in placentation.
NICD activates the transcription of several target genes, most notably the HEY1 and HEY2 genes, which are required for vascular development. These genes are expressed in the developing cardiovascular system, including the heart, endothelial cells and vascular smooth muscles, as well as in the placental labyrinth, while in mice Hey1 is additionally expressed in some trophoblast cells in the ectoplacental cone. Knockout of any of these genes leads to placental vascular deficiencies and to early embryonic lethality, due to major vascular and cardiac defects.
The aim of this study was to investigate the expression of receptors NOTCH1,-2,-3,-4, ligands DLL1,-3,-4, JAG1,-2 and target genes HEY1,-2 in placental tissue samples from 20 late preterm or term pregnancies complicated by PE versus 20 normal pregnancies. mRNA levels of the studied molecules were measured by quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR), while the
- 8 -
protein expression of the intracellular domain of NOTCH2 (NICD2) and NOTCH3 (NICD3) was measured by Western Blot (WB).
qRT-PCR analysis revealed that NOTCH1, NOTCH4 and DLL1 were not expressed in the placenta. Possible explanations regarding expression variations between our study and previous ones are the different experimental procedures used, since we measured expression with qRT-PCR while those studies used either Western Blot or immunohistochemistry, the different ethnic background of the study populations, and the temporal and spatial heterogeneity of the placental structures, since it is believed that CTBs alter the expression of Notch receptors and ligands as they differentiate.
On the contrary, NOTCH2, NOTCH3, DLL3, DLL4, JAG1, JAG2, HEY1 and HEY2 mRNA levels were downregulated in PE samples vs. controls (p<0.01). WB confirmed that NICD2 (p=0.014) and NICD3 (p<0.001) protein levels were also lower in PE specimens. Statistical analysis revealed several significant associations: of NOTCH3 mRNA expression with smoking during pregnancy (p=0.029), of NICD3 protein levels (p=0.028) and DLL3 mRNA levels (p=0.041) with birth weight centile, and of HEY2 transcript levels with parity (p=0.034) and mode of delivery (p=0.028).
The main strength of our research is that it is the first study to concurrently measure the mRNA levels of all key Notch signaling pathway molecules, and especially target genes HEY1 and HEY2, whose expression in human placenta have never been studied before, and to determine the associations between them. Study limitations include the fact that our research was conducted only on late preterm and term placentas, and therefore we were not able to measure the expression of the Notch pathway molecules during the earlier stages of pregnancy, and that our samples were whole tissue homogenates and not micro-dissected, which means that the measured expression of the Notch signaling pathway genes was their average expression among the various placenta cell types and not their expression in each cell type individually. Evidently, these limitations could also explain the differences between our results and those of some previously
- 9 -
conducted studies. Another potential limitation would be the differences in gestation period (shorter in PE cases), mode of delivery (since elective caesarean sections were more common in PE samples than in controls) and smoking status (since more women with PE smoked) between the two groups, which could introduce a possible bias in the results. However, since univariate analysis, with the aforementioned parameters as co-factors, found that the differences in the expression of all studied genes between PE cases and controls retained their statistical significance, our findings cannot be attributed to sampling bias, but are linked to PE pathophysiology.
Our findings, that receptors NOTCH2,-3, ligands DLL3,-4 and JAG1,-2 and target genes HEY1,-2 are downregulated in PE-complicated late preterm and term placentas, provide evidence that the Notch signaling pathway is associated with this pregnancy complication (visual depiction of the pathway in Fig. 4). Further research regarding the function of Notch receptors, ligands and target genes in the placenta is required in order to elucidate their role in PE pathogenesis and to determine whether one or more of these genes could be used as biomarkers for the early detection of PE, or for new preventive and therapeutic strategies.
(EN)
