Το εκκριτικό σύστημα τύπου ΙΙΙ (Τ3SS, Type three secretion system), είναι ένας εξειδικευμένος μοριακός μηχανισμός, ο οποίος καθιστά ικανά πολλά Gram-αρνητικά βακτήρια να εκκρίνουν και να διοχετεύουν τοξικές πρωτεΐνες στο κυτταρόπλασμα του ευκαρυωτικού ξενιστή τους. Στα φυτοπαθογόνα βακτήρια το μονοπάτι έκκρισης κωδικοποιείται από τα γονίδια hrp (HR και pathogenicity) και hrc (HR και conserved).
H παρούσα εργασία ασχολείται με τη δομική μελέτη τη πρωτεΐνης HrpA, η οποία είναι μια μικρή υδροφιλική πρωτεΐνη του Τ3SS της P. syringae pv. phaseolicola. H HrpA είναι η κύρια δομική πρωτεΐνη του αγωγού (pilus) του Τ3SS, του οποίου η δομή μοιάζει με τις γνωστές βελονοειδείς δομές (needle) των ζωοπαθογόνων βακτηρίων, ενώ η διάμετρος του υπολογίζεται περίπου στα 6 έως 8 nm και το μήκος μέχρι 2 μm. Η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη ΗrpA αγρίου τύπου, υπερεκφράστηκε και απομονώθηκε με χρωματογραφία συγγένειας. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε φυσικοχημική και δομική μελέτη της πρωτεΐνης, μεταβάλλοντας διάφορες παραμέτρους (pH, συγκέντρωση, χρόνο ανάπτυξης, θερμοκρασία) με μεθόδους κυκλικού διχρωισμού (CD), φασματοσκοπίας υπερύθρου με μετασχηματισμό Fourier (FTIR), φασματοσκοπίας Raman (Raman spectroscopy), και ηλεκτρονικής μικροσκοπίας διέλευσης υψηλής ανάλυσης (high resolution TEM).
Επιπλέον, πραγματοποιήθηκε δομικός και φυσικοχημικός χαρακτηρισμός του μεταλλάγματος HrpAΔC8 σε διάφορες συνθήκες με χρωματογραφία μοριακής διήθησης, CD, σκέδαση ακτίνων Χ σε μικρές γωνίες (SAXS) και high resolution TEM
Τέλος, ακολουθήθηκε πρωτόκολλο απομόνωσης του αγωγού του T3SS (pilus) από την P. syringae pv. phaseolicola, με σκοπό να μελετηθούν οι δομικές του ιδιότητες με ηλεκτρονική μικροσκοπία διέλευσης υψηλής ανάλυσης (HRTEM) και να συγκριθούν με τις πολυμερικές ιδιότητες που έχει η ανασυνδυασμένη HrpA να σχηματίζει ινώδεις δομές με χαρακτηριστικές διαστάσεις που κυμαίνονται από την μάκρο- στην μίκρο- κλίμακα. Σύμφωνα με τις παρατηρήσεις από το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο υψηλής διακριτικής ικανότητας, η πρωτεΐνη αυτό-οργανώνεται in vitro, σχηματίζοντας ινίδια με διαστάσεις που μοιάζουν σημαντικά με τα δομικά χαρακτηριστικά του αγωγού του T3SS της P. syringae pv. phaseolicola.
Συμπερασματικά, ενώ η HrpA προβλέπεται σαν α-ελικοειδής πρωτεΐνη, το φάσμα κυκλικού διχρωισμού της, παρουσιάζει χαμηλά ποσοστά α-έλικας ενώ μοιάζει πολύ με το φάσμα των αποδιπλωμένων πρωτεϊνών. Τα πειράματα φασματοσκοπίας RAMAN, FTIR και SAXS που πραγματοποιήθηκαν, επιβεβαιώνουν τις παρατηρήσεις από το CD.
(EL)
Type III secretion systems (T3SSs) are needle-like structures used by Gram negative bacteria to translocate bacterial proteins (effectors) into eukaryotic cells. The T3SS pathway of plant pathogens is encoded by hrp (HR and pathogenicity) and hrc (HR and conserved) genes.
The structural study of the HrpA protein, a small hydrophilic protein of the T3SS of P. syringae pv. phaseolicola will be presented. HrpA is the major component of T3SS pilus, a needle-like structure, whose diameter is about 6-8 nm and its length up to 2 μm. Recombinant wild type HrpA was overexpressed and purified by affinity chromatography. Moreover, physicochemical and structural study of HrpA protein was performed under different parameters (pH, concentration, shelf-life and temperature) with CD, FTIR, Raman spectroscopy and high resolution TEM.
In addition, physicochemical and structural characterization of deletion mutant (HrpAΔC8) also took place under various conditions with affinity chromatography, CD, SAXS and high resolution TEM.
Finally, the pilus of P. syringae pv. phaseolicola was purified in order to study its structural properties with HRTEM and to compare them with those of polymerized recombinant HrpA which forms fibre-like structures with nano- to micron scale features. According to the HRTEM observations, the in vitro formed fibers strongly resemble the structural parameters of Τ3SS pilus.
Whereas HrpA is predicted to be a highly α-helical protein, its CD spectra indicate very low α-helical content and strongly resemble those of disordered proteins. Raman spectroscopy, FTIR and SAXS also support the CD observations.
(EN)
