Η Γη αποτελείται από ποικίλα φυσικά περιβάλλοντα, τα οποία χαρακτηρίζονται στην πλειοψηφία
τους από ακραίες περιβαλλοντικές συνθήκες. Παρά αυτό το γεγονός, αναρίθμητοι οργανισμοί έχουν
βρεθεί να αποικίζουν και να ευδοκιμούν σε αυτά τα σκληρά και αφιλόξενα περιβάλλοντα. Μεταξύ
αυτών, οι πιο διαδεδομένοι, ονομάζονται ψυχρόφιλοι, καθώς έχουν προσαρμοστεί για επιβίωση σε
πολύ χαμηλές θερμοκρασίες. Αυτοί οι ψυχρόφιλοι οργανισμοί παρουσιάζουν ιδιαίτερο βιοτεχνολογικό
ενδιαφέρον, το οποίο επικεντρώνεται τα ένζυμα που κωδικοποιούν. Τέτοιου είδους προσαρμοσμένα
στο κρύο ένζυμα χαρακτηρίζονται από υψηλότερη καταλυτική ενεργότητα σε χαμηλές θερμοκρασίες
και μικρότερη θερμική σταθερότητα συγκριτικά με ομόλογα τους από μεσόφιλους οργανισμούς.
Τέτοιου είδους χαρακτηριστικά θεωρούνται ως πλεονέκτημα σε ποικίλες βιοτεχνολογικές εφαρμογές.
Σε προηγούμενη ερευνητική εργασία του εργαστηρίου MINOTECH biotechnology, μια βακτηριακή
συλλογή αποτελούμενη από 262 στελέχη, τα οποία συλλέχθηκαν από θαλάσσια ύδατα στην
Ανταρκτική, ελέγχθηκαν για την έκφραση ενεργότητας αλκαλικής φωσφατάσης. Εννέα από αυτά τα
στελέχη επιλέχθηκαν για αλληλούχιση του γονιδιώματος τους, καθώς παρουσίασαν υψηλή ενεργότητα
αλκαλικής φωσφατάσης αλλά και μείωση αυτής έπειτα από θερμική επεξεργασία. Το γονίδιο APT110α
από το στέλεχος TAP110α επιλέχθηκε και μετέπειτα απομονώθηκε, βάση της μεγάλης ομολογίας της
αλληλουχίας του και της συντήρησης των καταλοίπων του ενεργού κέντρου συγκριτικά με άλλες
χαρακτηρισμένες αλκαλικές φωσφατάσες. Το γονίδιο αυτό, κλωνοποιήθηκε σε κύτταρα Ε. coli
προκειμένου να επαληθευτεί η ενεργότητα αλκαλικής φωσφατάσης.
Στην παρούσα εργασία, η παραπάνω έρευνα συνεχίστηκε, με σκοπό τον βιοχημικό και βιοφυσικό
χαρακτηρισμό της TAP110α αλκαλικής φωσφατάσης, αλλά και τον ανασχεδιασμό των ιδιοτήτων της
μέσω εισαγωγής στοχευμένων μεταλλαγών στην αλληλουχία της. Αναλυτικότερα, παρουσιάζεται ένα
ολοκληρωμένο πρωτόκολλο καθαρισμού για την απομόνωση της TAP110α αλκαλικής φωσφατάσης.
Επιπροσθέτως, υπολογίστηκαν οι κινητικές παράμετροι του ενζύμου, ενώ η πρωτεΐνη κρυσταλλώθηκε
επιτυχώς και δεδομένα περίθλασης από την ακτινοβόληση τους συλλέχθηκαν, με απώτερο σκοπό την
ανάλυση της τριτοταγούς δομής του ενζύμου. Η τεχνική της φασματομετρίας κυκλικού διχρωισμού
χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση της θερμικής σταθερότητας αλλά και της δευτεροταγούς δομής του
ενζύμου. Τέλος, με βάση τα αρχικά αποτελέσματα από τον χαρακτηρισμό της TAP110α αλκαλικής
φωσφατάσης, σχεδιάστηκαν αμινοξικές μεταλλαγές με σκοπό την αύξηση της καταλυτικής ενεργότητας
του ενζύμου αλλά και την μείωση της θερμικής σταθερότητας του.
Με βάση τα αποτελέσματα από τα παραπάνω πειράματα, η TAP110α αλκαλική φωσφατάση
παρουσιάζει αξιοσημείωτη θερμική σταθερότητα συγκριτικά με ομόλογα ψυχρόφιλα ένζυμα.
Επιπροσθέτως, οι μεταλλαγές D179H και D179E έδειξαν ότι οδηγούν σε θερμική αστάθεια του ενζύμου,
με την μεταλλαγή D179E να αυξάνει και την ενεργότητα του ενζύμου. Ο χαρακτηρισμός και των άλλων
σχεδιασμένων μεταλλαγών ίσως να οδηγήσει σε περαιτέρω βελτίωση του ενζύμου. Τέλος, η
αποσαφήνιση της τρισδιάστατης δομής του ενζύμου θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για την
διερεύνηση των μηχανισμών θερμικής προσαρμογής του ενζύμου, αλλά και για τον σχηματισμό
περισσότερων κατευθυνόμενων μεταλλαγών.
(EL)
The majority of Earth’s environments are characterized by extreme biological conditions, which
facilitates their characterization as inhospitable by humans. Despite this, life has adapted to these harsh
habitats, as many organisms have been found to colonize and thrive in them, characterized as
extremophiles. The most widespread in this group are psychrophiles, meaning organisms that have
adapted to life in cold environments. This doesn’t come as a surprise, as most of Earth’s oceans and
around one fifth of Earth’s soils are permanently at temperatures below 5° C or covered by permafrost,
respectively. Psychrophilic organisms possess a special biotechnological interest, in terms of their
biocatalysts. Cold-adapted enzymes are, in general, characterized by higher catalytic activity at low
temperatures and heat- lability compared with their mesophilic counterparts. Both of this characteristics
are considered advantageous in many biotechnological applications.
In a previous study at MINOTECH biotechnology, a bacterial collection of 262 strains, collected from
the Antarctic Ocean, was screened for the expression of alkaline phosphatases activity, based on a
chromogenic-based high-throughput assay. The genome of nine strains with high and temperaturedepended
expression of alkaline phosphatase activity were sequenced and, based on sequence
similarity and the preservation of the active site residues with other characterized alkaline
phosphatases, the gene APT110α from the strain TAP110α was isolated. The corresponding gene
encoding for a putative psychrophilic alkaline phosphatase was cloned in E.coli for further
characterization.
In this thesis, the above research initiative was continued, with the biochemical and biophysical
characterization of TAP110α alkaline phosphatase, together with the rational redesigning of its
properties. In detail, a full purification scheme is standardized and presented for the isolation of
TAP110α. Furthermore, the kinetic parameters for the enzyme were calculated, while crystallization of
the protein resulted in the acquisition of diffraction data, in order to elucidate its three-dimensional
structure. Additionally, circular dichroism spectrometry was used to assess the thermal stability and
secondary structure of the enzyme. Lastly, based on the resulting information, amino acid substitutions
were designed and performed, in order to enhance both the catalytic activity and the heat- lability of
the enzyme. Similar characterization steps were followed for the resulting mutants.
Based on the results of these experiments, TAP110α alkaline phosphatase shows a striking
thermostability, resembling that of mesophilic homologous. Furthermore, the designed mutations
D179H and D179E result to a more heat-labile enzyme, while the mutant D179E shows also an increase
in activity. Characterization of all the designed mutants may further improve the TAP110α alkaline
phosphatase. Lastly, elucidation of its three-dimensional structure will give insights of its temperature
adaptation, and provide means for a more insightful and targeted redesigning of its properties.
(EN)
