Η ουροδόχος κύστη είναι ένα μυομεμβρανώδες υποπεριτοναϊκό όργανο, το οποίο
λειτουργεί ως δεξαμενή για τα ούρα στο ανθρώπινο σώμα. Ο καρκίνος της ουροδόχου
κύστεως είναι η 11η πιο συχνή μορφή κακοήθειας στον κόσμο και η 4η μεταξύ των
ανδρών στις ΗΠΑ, όπου μόνο το 2014 θα διαγνωσθούν 74.690 νέα περιστατικά της
νόσου. Το κάπνισμα και η έκθεση στις αρωματικές αμίνες έχουν αναγνωρισθεί ως
κύριοι παράγοντες κινδύνου για την εμφάνιση της νόσου, ενώ ακολουθούν οι χρόνιες
λοιμώξεις της ουροποιητικής οδού, η μόλυνση από το παράσιτο Schistosoma σε
συγκεκριμένες γεωγραφικές περιοχές, η έκθεση στην κυκλοφωσφαμίδη και η
ακτινοθεραπεία σε παρακείμενα όργανα. Υπολογίζεται ότι το 90-95% των όγκων είναι
ουροθηλιακά καρκινώματα, ενώ το υπόλοιπο 5-10% είναι ως επί το πλείστον
καρκινώματα εκ πλακώδους επιθηλίου και αδενοκαρκινώματα. Ο καθορισμός του
παθολογικού σταδίου του όγκου κατά την διάγνωση είναι καθοριστικής σημασίας για
την πρόγνωση, καθώς έχουν αναγνωρισθεί δύο φαινοτυπικές μορφές της νόσου με
ριζικά διαφορετική βιολογική συμπεριφορά. Οι καλά διαφοροποιημένοι (χαμηλού
grade), μη μυοδιηθητικοί όγκοι αποτελούν το 80% των περιστατικών, έχουν
περιορισμένο μεταστατικό δυναμικό και ευνοϊκή πρόγνωση όταν αντιμετωπιστούν
έγκαιρα, αν και συνοδεύονται από υψηλά ποσοστά υποτροπών. Αντίθετα, οι φτωχά
διαφοροποιημένοι (υψηλού grade) μυοδιηθητικοί όγκοι έχουν πολύ κακή πρόγνωση,
με τους περισσότερους ασθενείς να εμφανίζουν θανάσιμες μεταστάσεις παρά την
χειρουργική αφαίρεση και την συστημική θεραπεία. Οι γενετικές μεταβολές που
υπόκεινται στην εμφάνιση της νόσου περιλαμβάνουν χρωμοσωμικές ανωμαλίες,
μεταλλάξεις που απενεργοποιούν ογκοκατασταλτικά γονίδια και ενεργοποίηση
ογκογονιδίων. Μεταλλάξεις στον FGFR3 ανιχνεύονται σε περισσότερους από το 70%
των μη μυοδιηθητικών όγκων, ενώ το p53 βρίσκεται μεταλλαγμένο σε περίπου 50%
των μυοδιηθητικών όγκων.
Το TP53 είναι το καλύτερα μελετημένο ογκοκατασταλτικό γονίδιο. Μεταλλάξεις στο
γονίδιο TP53 έχουν αναφερθεί στην πλειοψηφία των ανθρώπινων όγκων, γεγονός
που υποδεικνύει σημαντική συνεισφορά του γονιδίου αυτού στην εμφάνιση
κακοηθειών. Πρόσφατα, αναγνωρίσθηκαν τα ομόλογα γονίδια του TP53, τα TP63 και
xxi
TP73. Αν και εμφανίζουν σημαντικές ομοιότητες με το TP53 όσον αφορά την
γονιδιακή οργάνωση, τα TP63 και TP73 χρησιμοποιούν περίπλοκους μηχανισμούς
προκειμένου να παράξουν δύο κύριες κατηγορίες πρωτεϊνικών ισομορφών με
ογκοκατασταλτική (ΤΑ ισομορφές) ή με ογκογόνο δράση (ΔN ισομορφές). Οι
ισομορφές TAp63 και TAp73 έχουν δράση παρόμοια με την p53 όσον αφορά την
επαγωγή της απόπτωσης, ενώ οι ΔNp63 και ΔNp73 (από τις οποίες λείπει το
αμινοτελικό άκρο) ρυθμίζουν με αρνητικό επικρατή τρόπο την αγρίου τύπου p53
πρωτεΐνη, αλλά και τις αντίστοιχες ΤΑ ισομορφές. Μεταλλάξεις στα TP63 και TP73
σπάνια ανιχνεύονται στους ανθρώπινους όγκους, ενώ η απαλειφή τους από
πειραματόζωα έχει ως αποτέλεσμα την εμφάνιση σοβαρότατων αναπτυξιακών και
νευρολογικών ανωμαλιών παρά την ανάπτυξη καρκινικών όγκων. Είναι λοιπόν
προφανές ότι τα TP63 και TP73 δεν μπορεί να θεωρούνται κλασικά ογκοκατασταλτικά
γονίδια.
Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν ο προσδιορισμός των
μεταγραφικών επιπέδων των τριών γονιδίων της οικογένειας p53 (TP53, TP63, TP73)
και των TA και ΔN ισομορφών των γονιδίων TP63 και TP73 και η αξιολόγηση πιθανών
μεταβολών στα πρότυπα έκφρασής τους οι οποίες θα μπορούσαν να συσχετισθούν με
την εμφάνιση και την εξέλιξη της νόσου. Η ανάλυση της έκφρασης πραγματοποιήθηκε
σε 30 ουροθηλιακούς καρκίνους, και 30 αντίστοιχους φυσιολογικούς ιστούς, οι οποίοι
ελήφθησαν από ασθενείς με καρκίνο της ουροδόχου κύστεως που υπεβλήθησαν σε
χειρουργική αφαίρεση του όγκου.
Η ανάλυση έδειξε αυξημένα μεταγραφικά επίπεδα των p53, p63 and p73 στο 47,0%,
40,0% και 43,0% των δειγμάτων, αντίστοιχα. Υπερέκφραση των p53, p63 και p73 κατά
1,9, 3,0 και 2,0 φορές αντίστοιχα ανιχνεύθηκε στα καρκινικά δείγματα σε σύγκριση με
τα φυσιολογικά. Στο φυσιολογικό ουροθήλιο, όλα τα γονίδια της οικογένειας p53
συνεκφράστηκαν (p&λτ0,001). Όμως, στο καρκινικό ουροθήλιο, διατηρήθηκε μόνο η
συνέκφραση των p63 και p73 (p=0,008). Η στατιστική ανάλυση έδειξε ότι το p53
υπερκφράζεται στους μη μυοδιηθητικούς όγκους (παθολογικών σταδίων Τα-Τ1) σε
σύγκριση με τους μυοδιηθητικούς (παθολογικών σταδίων Τ2-Τ4) (p=0,047). Σημαντικά
υψηλότερα μεταγραφικά επίπεδα του p63 μετρήθηκαν σε καρκινικά δείγματα από
ασθενείς άνω των 75 ετών σε σύγκριση με αυτά από νεότερους (p=0,022) και από
xxii
ασθενείς με υποτροπή της νόσου σε σύγκριση με αυτά από ασθενείς χωρίς υποτροπή
(p=0,045). Η έκφραση του p63 βρέθηκε να αποκλίνει σημαντικά από το φυσιολογικό
πρότυπο στους θηλώδεις όγκους σε σύγκριση με τους μη θηλώδεις (p=0,026).
Παρατηρήθηκε υπερέκφραση του p73 στους υψηλού grade (grade III) όγκους σε
σύγκριση με τους grade II όγκους, σε ασθενείς που διαγνώσθηκαν με μονήρεις όγκους
(p=0,040).
Επίσης, αυξημένα μεταγραφικά επίπεδα των ισομορφών TAp63, ΔNp63, TAp73 και
ΔNp73 μετρήθηκαν σε 33,0%, 50,0%, 40,0% και 37,0% των δειγμάτων, αντίστοιχα.
Υπερέκφραση των TAp63, ΔNp63, TAp73 και ΔNp73 κατά 2,9, 3,2, 1,7 και 3,3 φορές
αντίστοιχα ανιχνεύθηκε στα καρκινικά δείγματα σε σύγκριση με τα φυσιολογικά.
Μετάγραφα της ισομορφής TAp63 ανιχνεύθηκαν μόνο στο καρκινικό δείγμα σε 3
περιπτώσεις, ενώ τα ίδια μετάγραφα ανιχνεύθηκαν μόνο στο φυσιολογικό δείγμα σε
4 περιπτώσεις. Μετάγραφα της ισομορφής ΔNp73 ανιχνεύθηκαν μόνο στο καρκινικό
δείγμα σε 7 περιπτώσεις, ενώ τα ίδια μετάγραφα ανιχνεύθηκαν μόνο στο
φυσιολογικό δείγμα σε 4 περιπτώσεις. Επίσης, μετάγραφα της ισομορφής ΔNp73 δεν
ανιχνεύθηκαν σε 3 ζεύγη ιστών. Ο λόγος έκφρασης ΔNp63/TAp63 αυξήθηκε κατά 1,1
φορά υπέρ της ισομορφής ΔΝp63, και ο αντίστοιχος λόγος ΔNp73/TAp73 αυξήθηκε
κατά 2,0 φορές υπέρ της ισομορφής ΔΝp73 από τα φυσιολογικά στα καρκινικά
δείγματα. Στο φυσιολογικό ουροθήλιο, οι ισομορφές TAp73 και ΔNp73
συνεκφράστηκαν (p=0,003). Στο καρκινικό ουροθήλιο, η έκφραση των ισομορφών
ΔNp63 και TAp73 εμφάνισε αρνητική συσχέτιση (p=0,006). Η στατιστική ανάλυση
έδειξε ότι η ισομορφή ΔΝp63 υπερεκφράζεται στα καρκινικά δείγματα από ασθενείς
άνω των 75 ετών σε σύγκριση με αυτά από νεότερους (p=0,026), στους μη
μυοδιηθητικούς όγκους (παθολογικών σταδίων Τα-Τ1) σ ε σ ύγκριση μ ε τ ους
μυοδιηθητικούς (παθολογικών σταδίων Τ2-Τ4) (p=0,019) και σε ασθενείς που
υπεβλήθησαν σε θεραπεία BCG σε σ ύγκριση μ ε α υτούς π ου υ πεβλήθησαν σ ε
κυστεκτομή (p=0,045). Σημαντικά υψηλότερα μεταγραφικά επίπεδα της ισομορφής
TAp73 μετρήθηκαν σε ασθενείς με θηλώδεις όγκους σε σύγκριση με τους ασθενείς με
μη θηλώδεις όγκους (p=0,006) και σε καπνιστές σε σύγκριση με τους μη καπνιστές και
τους πρώην καπνιστές αθροιστικά (p=0,020).
xxiii
Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η έκφραση και των τριών γονιδίων της οικογένειας
p53 αποκλίνει από το φυσιολογικό πρότυπο στους όγκους της ουροδόχου κύστεως. Η
υπερέκφραση του p63 συσχετίσθηκε με έναν λιγότερο επιθετικό φαινότυπο, ενώ η
υπερέκφραση του p73 συσχετίσθηκε με μη ευνοϊκή πρόγνωση. Επίσης, παρέχονται
ενδείξεις ότι τα p63 and p73 συμβάλλουν στον κακοήθη μετασχηματισμό του
ουροθηλίου ανεξάρτητα από το p53. Επίσης, τα αποτελέσματά μας υποστηρίζουν τον
αντι-διηθητικό ρόλο που έχει προταθεί για την ισομορφή ΔNp63 στους
ουροθηλιακούς καρκίνους, αλλά και μία πιθανόν προστατευτική επίδραση της
ισομορφής TAp73 στο ουροθήλιο. Τέλος, παρέχονται ενδείξεις για επιγενετική
ρύθμιση της έκφρασης των ισομορφών των p63 and p73 στο φυσιολογικό και το
καρκινικό ουροθήλιο.
(EL)
The urinary bladder is a musculomembranous subperitoneal organ which functions as
a reservoir for the urine in the human body. Urinary bladder cancer is the 11th most
common malignancy worldwide and the 4th most common among males in the United
States, where 74,690 new cases will be diagnosed in 2014 alone. Smoking and
occupational exposure to aromatic amines are recognized as major risk factors for the
development of the disease, followed by chronic urinary tract infection, Schistosoma
infection in certain geographical regions, exposure to cyclophosphamide and
radiotherapy to adjacent organs. It is estimated that 90-95% of bladder cancer cases
are urothelial carcinomas, whereas the remaining 5-10% are mostly squamous cell
carcinomas and adenocarcinomas. Determination of tumor stage at diagnosis is crucial
for prognosis and patient management, as two major phenotypic variants of urothelial
tumors with drastically different biological behavior have been recognized. Low-grade
non-muscle-invasive tumors, comprising approximately 80% of the cases, have limited
invasive potential and come with favorable prognosis when treated early, although
accompanied by high recurrence rates. On the contrary, high-grade muscle-invasive
tumors have very bad prognosis, with most of the patients developing life-threatening
metastases despite surgical resection and systemic therapy. The genetic alterations
underlying the development of urothelial cancer include chromosomal aberrations,
inactivating tumor-suppressor gene mutations and activation of oncogenes. FGFR3
mutations are detected in more than 70% of non-muscle-invasive tumors, whereas p53
is mutated in almost 50% of the muscle-invasive lesions.
TP53 is the most extensively studied tumor-suppressor gene. Mutations in the TP53
gene have been reported in the majority of human malignancies, suggesting a
significant contribution to the development and progression of human tumors. Two
TP53 homologs, TP63 and TP73, have recently been identified. Though highly similar
with p53 regarding genomic organization, both p63 and p73 utilize complex
mechanisms to provide two major classes of protein isoforms with tumor-suppresive
(TA-isoforms) or tumorigenic function (ΔN-isoforms). TAp63 and TAp73 exhibit p53-like
function in terms of inducing apoptosis, whereas the N-terminally truncated ΔNp63
xvii
and ΔNp73 act as dominant negative inhibitors of both wild-type p53 protein and the
respective TA-isoforms. Both TP63 and TP73 are rarely mutated in human tumors,
whereas their deletion from mice results in various developmental and neurological
abnormalities rather than the development of malignant lesions. Overall, it is evident
that the two TP53 homologs are not to be considered as classic tumor-suppressor
genes.
The objective of this PhD thesis was to determine the expression levels of the three
p53 family genes (TP53, TP63, TP73) and the TP63 and TP73 TA and ΔN isoforms in
bladder tumors and to evaluate any alterations in their expression patterns that might
be associated with the development and progression of urothelial malignancies. The
expression analysis was performed in a set of 30 urothelial tumors, matched with
normal tissues, which were obtained from bladder cancer patients who underwent
surgical resection of bladder tumor.
Expression analysis revealed elevated p53, p63 and p73 mRNA levels in 47.0%, 40.0%
and 43.0% of the samples, respectively. p53, p63 and p73 exhibited a 1.9-fold, 3.0-fold
and 2.0-fold overexpression in tumor specimens compared with the normal samples,
respectively. In the normal bladder epithelium, all members of the p53 gene family
were co-expressed (p΄&λτ0.001). However, in malignant urothelium, only the positive coexpression
between p63 and p73 was maintained (p=0.008). Statistical analysis
revealed that p53 was up-regulated in non-muscle-invasive (pTa-T1) tumors compared
with muscle-invasive (pT2-T4) ones (p=0.047). Significantly higher p63 mRNA levels
were measured in malignant samples from patients ΄&γτ 75 years of age versus younger
patients (p=0.022) and from patients with disease relapse compared with cancer-free
patients (p=0.045). p63 expression significantly deviated from the normal pattern in
papillary versus non-papillary lesions (p=0.026). p73 overexpression was observed in
Grade III tumors compared with Grade II tumors, in patients presenting with one-site
lesions (p=0.040).
Also, elevated TAp63, ΔNp63, TAp73 and ΔNp73 mRNA levels were measured in 33.0%,
50.0%, 40.0% and 37.0% of the samples, respectively. TAp63, ΔNp63, TAp73 and
ΔNp73 exhibited a 2.9-fold, 3.2-fold, 1.7-fold and 3.3-fold overexpression in tumor
xviii
specimens compared with the normal samples, respectively. Tumor-specific TAp63
expression was detected in 3 cases, while TAp63 was expressed only in normal tissue
in 4 cases. Tumor-specific ΔNp73 expression was detected in 7 cases, while ΔNp73 was
expressed only in normal tissue in 4 cases. ΔNp73 was also not expressed in 3 tissue
pairs. The ΔNp63/TAp63 isoform ratio shifted 1.1-fold in favor of ΔΝp63, and the
ΔNp73/TAp73 isoform ratio shifted 2.0-fold in favor of ΔΝp73 from normal to tumor
specimens. In normal urothelium TAp73 was co-expressed with ΔNp73 (p=0.003). In
the malignant bladder epithelium ΔNp63 negatively correlated with TAp73 (p=0.006).
Statistical analysis revealed that ΔΝp63 was up-regulated in tumor samples from
bladder cancer patients ΄&γτ 75 years old versus younger ones (p=0.026), in non-muscleinvasive
(pTa-T1) tumors versus muscle-invasive ones (pT2-T4) (p=0.019) and in
patients who received BCG treatment versus those who were treated with cystectomy
(p=0.045). TAp73 mRNA levels were increased in patients with papillary tumors
compared with those with non-papillary ones (p=0.006) and in current smokers
compared with non-smokers and ex-smokers combined (p=0.020).
Our results indicate that expression of all TP53 family members deviate from the
normal pattern in bladder tumors. p63 overexpression is associated with a less
aggressive tumor phenotype, whereas p73 up-regulation correlates with an
unfavorable patient outcome. We also provide evidence that p63 and p73 exert their
contribution to the malignant transformation of the bladder epithelium independently
of p53. In addition, our results support an anti-invasive role for ΔNp63 in urothelial
cancers and a potentially protective effect of TAp73 on bladder epithelium. Finally, we
provide evidence for epigenetic regulation of p63 and p73 isoforms expression in
normal and malignant urothelium.
(EN)
