Τα μιτοχόνδρια είναι οργανίδια απαραίτητα για την βιωσιμότητα των περισσότερων ευκαρυωτικών κυττάρων και η βιογένεσή τους στηρίζεται στα μονοπάτια εισόδου πρωτεϊνών σε αυτά. Η γλουταμική αφυδρογονάση (GDH) είναι ένα ένζυμο με κεντρικό ρόλο στον κυτταρικό μεταβολισμό και έχει βρεθεί σε όλους σχεδόν τους ζώντες οργανισμούς. Στα θηλαστικά η GDH αποτελεί σε ορισμένες περιπτώσεις περισσότερο από το 10% των πρωτεϊνών της μιτοχονδριακής μήτρας. Στον άνθρωπο και τα ανώτερα πρωτεύοντα εμφανίζεται με δύο ισομορφές, την hGDHI και την hGDH2, οι οποίες έχουν ένα ασυνήθιστα μεγάλο σινιάλο μιτοχονδριακής στόχευσης (MTS) αποτελούμενο από 53 αμινοξέα (Ν53). Το Ν53 έχει την τάση σχηματισμού δύο αμφιπαθών α-ελίκων (α1, α2). Η παρούσα διδακτορική διατριβή είχε σκοπό τον χαρακτηρισμό του πεπτιδίου Ν53 των hGDHs και την μελέτη της εξέλιξης του MTS της GDH μεταξύ των οργανισμών.
Στο πρώτο τμήμα της διατριβής, βρήκαμε ότι οι in vitro συντιθέμενες hGDHs μπορούν να εισέλθουν, να κοπούν και να σχηματίσουν εξαμερή σε απομονωμένα μιτοχόνδρια σακχαρομύκητα. Η είσοδος των hGDHs στα μιτοχόνδρια εξαρτάται από το κανάλι TIM23, το ηλεκτροχημικό δυναμικό της εσωτερικής μιτοχονδριακής μεμβράνης και τη συγκέντρωση των δισθενών μεταλλικών ιόντων. Παρόλο που τα τμήματα N53 των hGDHI και hGDH2 έχουν 83% ομολογία, βρέθηκε ότι η ισομορφή hGDH2 μπαίνει ή/και αποκόπτεται ταχύτερα στα μιτοχόνδρια από ότι η hGDHI. Με το ερώτημα αν υπάρχουν διαφοροποιήσεις στην μιτοχονδριακή στόχευση στον άνθρωπο λόγω της μεταλλαγής G35R στην hGDH2 που προκύπτει από τον συχνό στον πληθυσμό πολυμορφισμό του γονιδίου GLUD2 C.G103A (Plaitakis et al, 2010), μελετήσαμε την επίδρασή της μεταλλαγής αυτής σε μιτοχόνδρια και είδαμε ότι δεν επηρεάζει την είσοδό της hGDH2 στα μιτοχόνδρια σακχαρομύκητα. Επίσης, με σκοπό να φτιάξουμε μία κατασκευή που να μπορεί χρησιμοποιηθεί για την εύρεση μοριακών συνοδών της hGDH1, βρήκαμε ότι η εισαγωγή του επιτόπου His στο καρβοξυτελικό άκρο της hGDHI (hGDH1-His), δεν επηρεάζει την ικανότητά της να στοχεύεται στα μιτοχόνδρια και να δημιουργεί εξαμερή.
Μελετήσαμε το πεπτίδιο Ν53 κατά τμήματα και επίσης ξεχωριστά από την υπόλοιπη hGDH, ώστε να κατανοήσουμε της ιδιότητές του. Πειράματα εισόδου σε απομονωμένα μιτοχόνδρια έδειξαν ότι το πεπτίδιο Ν53 είναι απαραίτητο για την μιτοχονδριακή στόχευση των hGDHs και είναι ικανό από μόνο του να οδηγήσει την μη μιτοχονδριακή πρωτεΐνη DHFR στα μιτοχόνδρια. Επίσης, βρέθηκε ότι όταν απουσιάζει η α1 έλικα της hGDH2, η
hGDH2 χάνει την ικανότητα της για μιτοχονδριακή στόχευση. Παρατηρήθηκε ότι η αϊ της hGDH2 όταν συζευχθεί στο Ν-τελικό άκρο (αϊ-DHFR), αλλά όχι με στο C-τελικό του DHFR (DHFR-α1), μπορεί να οδηγήσει το πεπτίδιο DHFR στα μιτοχόνδρια. Αντίθετα, η α2 δεν βρέθηκε να έχει αυτόνομη ικανότητα μιτοχονδριακής στόχευσης. Παρατηρήθηκε ότι το συζευγμένο πεπτίδιο α1α2, αλλά όχι το πεπτίδιο α1 από μόνο του, είναι ικανό να οδηγήσει στα μιτοχόνδρια την ώριμη hGDH2. Τα ευρήματά μας είναι σε συμφωνία με πειράματα που έγιναν από τους συνεργάτες μας του Εργαστηρίου Νευρολογίας του Πανεπιστημίου Κρήτης σε κυτταρικές σειρές θηλαστικών με τον επίτοπο EGFP. Ως εκ τούτου, βρέθηκε ότι η μιτοχονδριακή στόχευση της hGDH2 στηρίζεται στη συνεργατική δράση των δύο α-ελίκων και ότι η α1 έχει πρωταγωνιστικό ρόλο.
Γενικά, θεωρείται ότι τα MTS δεν έχουν κάποιο συγκεκριμένο αμινοξικό μοτίβο, αλλά είναι πλούσια σε θετικά φορτισμένα αμινοξέα, χαρακτηρίζονται από αμφιπαθικότητα και τάση για δημιουργία α-έλικας. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι το ηλεκτρικό φορτίο στο Ν-τελικό άκρο του πεπτιδίου Ν53 της hGDH2 είναι πιο σημαντικό για την μιτοχονδριακή στόχευση της από ότι η αμφιπαθικότητα, η ελικοειδής διαμόρφωση και το φορτίο στο C-τελικό άκρο του. Επίσης, βρέθηκε ότι η πρωτεολυτική αποκοπή του Ν53 δεν είναι απαραίτητη για την μιτοχονδριακή στόχευση των hGDHs.
Στο δεύτερο τμήμα της διατριβής, μελετήθηκε η εξέλιξη του MTS της GDH μεταξύ των οργανισμών χρησιμοποιώντας in silico προγράμματα πρόβλεψης για ~170 διαφορετικές πρωτεϊνικές αλληλουχίες GDH. Προβλέφθηκε ότι η εμφάνιση ύπαρξης αποκοπτόμενου MTS πιθανώς να ξεκίνησε από τα βλεφαριδοφόρα πρωτόζωα και να εξελίχθηκε σταδιακά σε ένα πολύ ισχυρό, μεγαλύτερο, περισσότερο θετικά φορτισμένο και πολυπλοκότερο σινιάλο MTS στα θηλαστικά, με πιθανή εξαίρεση την GDH στα πτηνά και τα ερπετά. Επίσης, προβλέφθηκε ότι τα φυτά έχουν μη αποκοπτόμενο MTS στην GDH, ενώ δεν καταφέραμε να προβλέψουμε MTS στην GDH στους μύκητες. Στα θηλαστικά παρατηρήθηκε ότι τα αμινοξέα που απαρτίζουν την αϊ έλικα είναι εξελικτικά περισσότερο συντηρημένα σε σχέση με αυτά που απαρτίζουν την α2 έλικα.
Πειραματικές in vivo και in organello μελέτες σε συνεργασία με το Εργαστήριο Νευρολογίας έδειξαν ότι τα MTS της GDH των οργανισμών T. thermophila (βλεφαριδοφόρο), C. elegans (σκουλήκι), D. melanogaster (μύγα) και X. laevis (βατράχι) είναι ικανά να στοχεύσουν τις πρωτεΐνες DHFR και EGFP στα μιτοχόνδρια. Αντίθετα, βρέθηκε ότι το MTS της T. thermophila αδυνατεί να στοχεύσει αποδοτικά την ώριμη hGDH2 στα μιτοχόνδρια. Τα ευρήματα της παρούσας μελέτης στοιχειοθετούν ένα σημαντικό βήμα προς την πλήρη αποκάλυψη των μοριακών ιδιοτήτων, των λειτουργικών χαρακτηριστικών και της εξέλιξης των σινιάλων μιτοχονδριακής στόχευσης για την μιτοχονδριακή βιογένεση.
(EL)
Mitochondria are essential organelles of most eukaryotic cells and their biogenesis relies on mitochondrial protein import pathways. Glutamate dehydrogenase (GDH), an enzyme that plays a central role in cellular metabolism, is present in almost all living organisms. In mammals, GDH makes up, in some instances, more than 10% of the mitochondrial matrix proteins. In human and in great apes it exists in two isoforms, hGDH1 and hGDH2, which both have an unusually large mitochondrial targeting signal (MTS) consisting of 53 amino acid residues (N53). Their N53 peptide has the tendency to form two amphipathic α-helices (α1, α2). In this PhD thesis, the N53 peptides of hGDHs were characterized. Moreover, the evolution of the GDH MTS among organisms was studied.
In the first section we have found that the in vitro synthesized hGDHs can be efficiently imported, proteolytically processed into isolated yeast mitochondria and they form hexamers. The mitochondrial import of hGDHs process depends on the TIM23 complex, on the mitochondrial inner membrane potential and on the concentration of divalent metal ions. Although the N53 peptides of hGDHs share 83% homology, we observed that the isoform hGDH2 is imported or/and processed faster in mitochondria than hGDH1. We observed that the mutation G35R in hGDH2, that arises from the common polymorphism GLUD2(c.G103A) (Plaitakis et al, 2010), does not affect its mitochondrial targeting capacity. Furthermore, in order to make a construct that can be used to search new molecular protein partners of hGDH1, we found that the addition of the epitope His at the C-terminus of hGDH1 (hGDH1-His) does not interrupt either the mitochondrial targeting efficiency or hexameric formation.
We studied the N53 peptide in portions and separate from the rest hGDH, in order to understand its properties. Import experiments in already isolated mitochondria showed that the N53 peptides of hGDHs are essential for mitochondrial localization of hGDHs and they are able to target the non-mitochondrial protein DHFR into mitochondria. Additionally, deletion of the α1 helix of hGDH2 abolishes its mitochondrial import. The α1 helix of hGDH2 is sufficient to target the DHFR protein into mitochondria, when it is fused N-terminally (α1-DHFR) but not, when it is fused C-terminally (DHFR-α1). However, the α2 does not seem to have an autonomous mitochondrial targeting capacity. We found also that the fused peptide α1α2, but not the α1 alone, is able to target the mature hGDH2 protein into mitochondria. Our findings are in agreement with experiments in mammalian cell lines with the epitope EGFP from our collaborators at the Neurology Laboratory of the University of Crete. Therefore, we found that the mitochondrial targeting of hGDH2 relies on the synergistic effect of the two α-helical structures, with the first one having the leading role.
It is generally believed that the MTS do not have a common motif. However, the MTS are rich in positively charged amino acids and are characterized by amphipathicity and tendency for α-helix formation. Our data suggest that the net positive charge of the N-terminal part of the N53 of hGDH2 rather than the net positive charge of the C-terminal part of the N53 or the amphipathicity and propensity for α-helix formation is the main determinant for their mitochondrial import. Moreover, the proteolytic removal of the N53 in the mitochondrial matrix is not essential for the import of hGDHs in mitochondria.
In the second section, we have studied the evolution of the MTS of GDH among organisms using in silico prediction programs for ~170 distinct GDH proteins. This study suggested that the GDH cleavable MTS first arose in the kingdom of ciliophora protista and then evolved step by step into highly efficient, substantially complex and more positive charged MTS in mammals, with potential exceptions the GDH in birds and reptiles. Moreover, the plants are predicted to have GDH with non-cleaved MTS and we failed to predict MTS in the GDH in fungi. In addition, our analyses showed that in mammals, the α1 helix is evolutionary more conserved than the α2 helix
Experimentally, in vivo and in organello studies carried out in collaboration with the Neurology Laboratory showed that the MTS of GDH from T. thermophila (ciliate), C. elegans (roundworm), D. melanogaster (fly) and X. laevis (frog) alone are able to target DHFR and EGFP into mitochondria. However, the MTS of GDH from T. thermophila seems not to be sufficient to target efficiently the mature hGDH2 into mitochondria.
The findings of the present study are an important step towards revealing the full molecular details underlying the functional characteristics and the evolution of the mitochondrial targeting signals for mitochondrial biogenesis.
(EN)
