Μελέτη των δομικών και λειτουργικών διαφορών μεταξύ των δύο ανθρώπινων ισοενζύμων γλουταμικής αφυδρογόνασης

 
This item is provided by the institution :
University of Crete
Repository :
E-Locus Institutional Repository
see the original item page
in the repository's web site and access all digital files if the item*
share



PhD thesis (EN)

2005 (EN)
Μελέτη των δομικών και λειτουργικών διαφορών μεταξύ των δύο ανθρώπινων ισοενζύμων γλουταμικής αφυδρογόνασης

Ζαγανάς, Ιωάννης Β (EL)
Zaganas, Ioannis B (EN)

Στα θηλαστικά, η γλουταμική αφυδρογονάση (GDH) παίζει ένα σημαντικό ρόλο στον κυτταρικό μεταβολισμό, συνδέοντας των μεταβολισμό των αμινοξέων με αυτόν των υδατανθράκων. Στον εγκέφαλο των θηλαστικών, όπου η GDH εντοπίζεται κυρίως στα αστροκύτταρα, φαίνεται να συμμετέχει στον μεταβολισμό του γλουταμικού ως διαβιβαστή. Η ανθρώπινη GDH υπάρχει σε δύο ισομορφές, που κωδικοποιούνται από τα γονίδια GLUD1 και GLUD2, αντιστοίχως, και διαφέρουν, στην ώριμη μορφή τους, σε μόνο 15 από τα 505 αμινοξέα τους. Το γονίδιο GLUD1 είναι αυτοσωματικό, περιέχει ιντρόνια και εκφράζεται σε όλους τους ιστούς, συμπεριλαμβανομένου και του εγκεφάλου. Αντιθέτως, το γονίδιο GLUD2 βρίσκεται στο Χ χρωμόσωμα, δεν περιέχει ιντρόνια και εκφράζεται ειδικώς στον εγκέφαλο και τον όρχι. Τα δύο αυτά ισοένζυμα GDH στον άνθρωπο διαφέρουν σημαντικά ως προς τις κινητικές τους ιδιότητες και την αλλοστερική τους ρύθμιση, παρά τις μικρές μόνο διαφορές στην αμινοξική αλληλουχία τους. Συγκεκριμένα, η GLUD1 αναστέλλεται ισχυρά από μικρές συγκεντρώσεις GTP και η αναστολή αυτή εμφανίζει θετική συνεργατικότητα, ενώ η GLUD2 απαιτεί πολύ μεγαλύτερες συγκεντρώσεις GTP για να ανασταλεί και η αναστολή συτή χαρακτηρίζεται από αρνητική συνεργατικότητα. Επιπλέον, η GLUD2 σε απουσία ADP ή L-λευκίνης είναι σχεδόν ανενεργή, σε αντίθεση με το GLUD1 ισοένζυμο, το οποίο παρουσιάζει μία σημαντική βασική δραστηριότητα σε απουσία ενεργοποιητών. Η προσθήκη ADP ή L- λευκίνης στην αντίδραση ενεργοποιεί σημαντικά το GLUD2 ισοένζυμο, αποκαθιστώντας την δραστηριότητά του σε επίπεδα παρόμοια με αυτά της GLUD1. Οι παραπάνω ιδιότητες επιτρέπουν πιθανότατα στο GLUD2 ισοένζυμο να λειτουργεί στις ιδιαίτερες συνθήκες του νευρικού ιστού, όπως είναι οι καταστάσεις χαμηλού ενεργειακού φορτίου (υψηλή αναλογία ADP:ATP) κατά τη διάρκεια της έντονης γλουταματεργικής διαβίβασης και οι υψηλές συγκεντρώσεις GTP στον εγκέφαλο. Με σκοπό να διερευνήσουμε την δομική βάση των μεγάλων αυτών λειτουργικών διαφορών των δύο ισοενζύμων GDH, πραγματοποιήσαμε ειδική ως προς τη θέση μεταλλαξιογένεση στο GLUD1 ένζυμο σε θέσεις όπου αυτό διαφέρει από το GLUD2 ισοένζυμο, αντικαθιστώντας το κάθε αμινοξύ σε αυτές τις θέσεις με το αντίστοιχό του vi που υπάρχει στην GLUD2. Οι μελέτες μας έδειξαν ότι η αντικατάσταση της Gly456 από Ala έκανε το ένζυμο ανθεκτικό στην αναστολή από GTP και οδήγησε στην απώλεια της θετικής συνεργατικότητας αυτής της αναστολής. Επιπλέον, αντικατάσταση της Arg443 από Ser κατήργησε την βασική δραστηριότητα του μεταλλαγμένου GLUD1 ενζύμου και το έκανε να αποκτά επίπεδα δραστηριότητας συγκρίσιμα με αυτά του αρχικού ενζύμου μόνο μετά από την προσθήκη ADP στην αντίδραση. Μεταλλάξεις σε μία σειρά από θέσεις στις οποίες διαφέρουν τα δύο GDH ισοένζυμα μεταξύ τους (Ser331Thr, Met370Leu, Met415Leu, Arg470His και Asn498Ser) δεν επηρέασαν την αλλοστερική ρύθμιση και τις κινητικές ιδιότητες του GLUD1 ισοενζύμου. Με βάση τα παραπάνω αποτελέσματα, έγινε εμφανές ότι οι κύριες λειτουργικές διαφορές μεταξύ των δύο GDH ισοενζύμων μπορούν να αποδοθούν σε δύο μόνο αμινοξικές αντικαταστάσεις (Arg443Ser και Gly456Ala). Το χωρίς ιντρόνια GLUD2 γονίδιο έχει δειχθεί ότι δημιουργήθηκε από το GLUD1 γονίδιο με μηχανισμό ρετρομετάθεσης σε κάποιο κοινό πρόγονο του ανθρώπου και των πιθήκων. Στη συνέχεια, ο συνδυασμός τυχαίων μεταλλάξεων και της πίεσης της φυσικής επιλογής προσέδωσε στο GLUD2 γονίδιο τις σημερινές του ιδιότητες. Οι δύο αμινοξικές αντικαταστάσεις Arg443Ser και Gly456Ala είναι, σύμφωνα με τις μελέτες μας, οι κύριες εξελικτικές αλλαγές που οδήγησαν στην προσαρμογή της GLUD2 GDH στις ιδιαίτερες μεταβολικές ανάγκες του νευρικού ιστού, συνεισφέροντας πιθανότατα στην σημαντική λειτουργική διαφοροποίηση του ανθρώπινου εγκεφάλου από αυτόν των άλλων θηλαστικών. (EL)
Mammalian glutamate dehydrogenase (GDH) has been shown to play an important role in cellular homeostasis by interconnecting amino acid and carbohydrate metabolism. In mammalian brain, where GDH is localized mainly in astrocytes, there is evidence that this enzyme contributes to the metabolism of the neurotransmitter glutamate. Human GDH exists in two isoforms, which are encoded by the GLUD1 and GLUD2 genes, respectively, and share, in their mature form, all but 15 of their 505 amino acids. The GLUD1 gene is autosomal, contains introns and is expressed in all tissues, including brain tissue. On the other hand, the intronless GLUD2 gene is X-linked and is expressed only in brain and testis. The two human GDH isoenzymes differ significantly in their kinetic properties and their allosteric regulation, despite the small differences in their amino acid sequence. Specifically, GLUD1 is inhibited potently by GTP and this inhibition shows positive cooperativity, while GLUD2 GDH requires significantly higher GTP concentrations to be inhibited and this inhibition is characterized by negative cooperativity. Moreover, the GLUD2 enzyme in the absence of ADP or L-leucine is essentially inactive, in contrast to the GLUD1 isoenzyme, which shows a significant basal activity in the absence of activators. Addition of ADP or L-leucine activates the GLUD2 isoenzyme, restoring its activity to levels comparable to those of GLUD1 GDH. The above properties probably permit the GLUD2 isoenzyme to function under the unique conditions of the nervous tissue, such as the states of low energy charge (high ADP:ATP ratio) occurring during intense glutamatergic transmission and the high GTP concentrations that are found in brain. Aiming to decipher the structural basis of these significant functional differences between the two GDH isoenzymes, we performed site-directed mutagenesis of the GLUD1 enzyme at sites that it differs from the GLUD2 isoenzyme, replacing each amino acid at these sites with the corresponding amino acid of the GLUD2 GDH. Our studies showed that replacement of Gly456 by Ala made the enzyme resistant to GTP inhibition and led to the loss of the positive cooperativity associated with this inhibition. Moreover, replacement of Arg443 by Ser abolished the basal activity of the GLUD1 enzyme and rendered the enzyme dependent on ADP for its function. Mutagenesis at other sites that viii differ between the two GDH isoenzymes (Ser331Thr, Met370Leu, Met415Leu, Arg470His και Asn498Ser) did not affect the allosteric regulation and the kinetic properties of the GLUD1 isoenzyme. The above results showed that the main functional differences between the two human GDH enzymes can be attributed to only two amino acid changes (Arg443Ser and Gly456Ala). It has been shown that the intronless GLUD2 gene has evolved from the GLUD1 gene by retrotransposition in a common ancestor of man and modern apes. Consequently, the combination of random mutations and the pressure of natural selection gave the GLUD2 gene its present properties. The two amino acid substitutions Arg443Ser and Gly456Ala are, according to our studies, the main evolutionary changes that led to the adaptation of GLUD2 GDH to the unique metabolic needs of the nervous tissue, possibly contributing to the significant functional differentiation of the human brain as compared to that of other mammals. (EN)

Τύπος Εργασίας--Διδακτορικές διατριβές
text

Πανεπιστήμιο Κρήτης (EL)
University of Crete (EN)

2006-09-25
2005-12-01


Σχολή/Τμήμα--Ιατρική Σχολή--Τμήμα Ιατρικής--Διδακτορικές διατριβές



*Institutions are responsible for keeping their URLs functional (digital file, item page in repository site)